薄膜过滤法微生物限度检查操作要点

薄膜过滤法微生物限度检查操作要点
1. 设备、仪器
无菌室微生物限度检查应有单独的无菌室，每个无菌室应有独立的净化空气系统。

操作间操作间应安装空气除菌过滤层流装置。

环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。

操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正压，不低于。

操作台上备有电子天平，乙醇灯，火柴，乙醇棉球，大、小橡皮乳头等。

缓冲间缓冲间内应有洗手盆，无菌衣、帽、口罩、拖鞋等。

缓冲间内不得放置培养箱和其他杂物。

在每次操作前、后，用75%乙醇溶液或其他消毒液擦拭操作台及可能污染的死角。

然后启动层流净化装置，同时用紫外杀菌灯照射30min。

无菌室操作台消毒擦拭后，先启动层流净化装置30min，将备妥的营养琼脂平板3个（经30～350C预培养48h，证明无菌落生长），以无菌方式移入操作间，置净化台左、中、右各1个，开盖，暴露30min 后将盖盖上。

在30～350C培养箱内倒置培养48h，取出检查。

3个平板生长的平均菌落数不超过1个。

仪器
恒温培养箱（30～350C）、生化培养箱（23～280C）、电冰箱、蒸汽灭菌器。

玻璃器皿烧杯、培养皿、量筒、试管及塞、吸管。

玻璃器皿用前应洗涤干净，吸管、量筒不挂水滴，无残留抗菌物质。

玻璃器皿均应用牛皮纸（或双层报纸）严密包裹置蒸汽灭菌器高压蒸汽121℃灭菌30min，烘干。

或于160℃干热灭菌2h，备用。

2培养基及其制备方法
营养琼脂培养基：取营养琼脂培养基34g，加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟。

玫瑰红钠琼脂培养基：取玫瑰红钠琼脂培养基，加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟。

胆盐乳糖培养基：取胆盐乳糖培养基36g，加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟。

3 稀释剂
%无菌氯化钠溶液：取氯化钠，加水溶解使成1000ml，121℃灭菌20分钟。

无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液：取磷酸二氢钾，磷酸氢二钠，氯化钠，蛋白胨，加水1000ml，微温溶解，分装，过滤，灭菌。

4 供试液的制备
取供试品10g，加经干热灭菌的5%吐温-80 ，加无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100ml，边加边振摇使成混悬液，静止5分钟使分层，倾取上清液置离心机中500r/min离心5分钟，取上清液作为供试品溶液。

5 检查方法
采用薄膜过滤法，滤膜孔径为，直径为50mm。

滤膜及滤器在使用前采用121℃高压灭菌30钟。

试验过程中，应保持滤膜前后的完整性。

将制备好的供试液过滤，然后用无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（注意保持供试品溶液覆盖整个滤膜表面）。

冲洗后，用镊子取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基平板上培养。

细菌于30～35℃培养48小时，霉菌于23～28℃培养72小时。