高效液相色谱法同时检测祛痘类化妆品中12种禁限用物质

高效液相色谱法同时检测祛痘类化妆品中12种禁限用物质雷毅;何嘉雯;黄艳婷;黄文静
【摘要】建立了反相高效液相色谱同时测定祛痘类化妆品中12种禁限用物质(依诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯、氯霉素、氯霉素二醇物、磺胺甲(噁)唑、甲硝唑、替硝唑、水杨酸)的方法.样品经甲醇与0.1 mol/L盐酸混合溶液(体积比1∶1)超声提取,采用ACE C18(250 mm
×4.6mm,5μm)色谱柱分离,以乙腈-0.025 mol/L磷酸三乙胺溶液二元流动相梯度洗脱,流速1.5 mL/min,柱温40℃,采用二极管阵列检测器双波长(210、277 n m)检测,外标法定量.林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯3种成分的线性范围为25～1 000 mg/L,其他9种成分的线性范围为5～200 mg/L,相关系数均大于
0.997.12种禁限用物质的方法检出限为5～50μg/g,平均回收率为88％～115％,相对标准偏差为0.4％～3.0％.该方法操作简便、准确、灵敏,适用于祛痘类化妆品中12种禁限用物质的测定.%A method for the simultaneous determination of 12 banned and restricted substances, including enoxacin, ciprofloxacin, ofloxacin, lincomycin, clindamycin, clindamycin phosphate, chloramphenicol, p-nitropheny-2-amino-1.3-propanediol, sulfamethoxazole, metronidazole, tin-dazole and salicylic acid was developed by reversed-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) with diode array detector (DAD). The above twelve substances were extracted ultra-sonically with methanol - 0. 1 mol/L hydrochloric acid (1 : 1). The analytes were separated on an ACE C18(250 mm×4. 6 mm, 5
μm) column by gradient elution with 0.025 mol/L phosphoric acid triethylamine-acetonitrile as mobile phase, and detected at the
wavelengths of 210 nm and 277 nm, respectively. The flow rate was set at 1. 5 mL/min and the co lumn temperature was 40℃. Identification of the 12 banned and restricted substances was achieved by the retention time and the DAD spectra. Quantification analysis was performed by the external standard method. Under the optimal conditions , the detection limits of twelve substances were in the range of 5 - 50 μg/g. The calibration curves were linear in the range of 25 -1 000 mg/L for lincomycin, clindamycin, clindamycin phosphate , and 5 - 200 mg/L for the rest of analytes, with correlation coefficients more than 0. 997. The average recoveries at two spiked levels ranged from 88% to 115% with RSDs of 0. 4% -3. 0% . The results indicated that the method was simple, sensitive and accurate, and was suitable for the determination of 12 banned and restricted substances in anti-acne cosmetics.
【期刊名称】《分析测试学报》
【年(卷),期】2013(032)003
【总页数】5页(P326-330)
【关键词】高效液相色谱法;祛痘类化妆品;禁限用物质
【作者】雷毅;何嘉雯;黄艳婷;黄文静
【作者单位】广东省食品药品检验所,广东广州510180;广东省食品药品检验所,广东广州510180;广东省食品药品检验所,广东广州510180;广东省食品药品检验所,广东广州510180
【正文语种】中文
【中图分类】O657.72;TQ460.72
祛痘或抑制粉刺类化妆品是目前监管难度最大的化妆品类别之一，其非法添加抗菌类药物的现象比较普遍。

鉴于滥用抗菌类药物的严重后果，我国和欧美发达国家均将抗菌类药物列入化妆品禁用或限用物质名单。

有关高效液相色谱法、液相色谱－质谱联用法测定祛痘类化妆品中抗菌类药物的方法已有文献报道［1－16］，检测的各类目标成分很多，已发现的非法添加成分主要有甲硝唑、氯霉素、水杨酸、氧氟沙星、环丙沙星等。

通过深入研究发现，目前国内祛痘类化妆品非法添加的化学成分主要包括依诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯、氯霉素、氯霉素二醇物、磺胺甲口恶唑、甲硝唑、替硝唑和水杨酸12种。

其中，氯霉素、依诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯、磺胺甲口恶唑、甲硝唑、替硝唑等10种成分属临床常用抗菌类处方药，为禁用物质;水杨酸属消毒防腐类药物，《化妆品
卫生规范》2007年版规定其为限用物质，明确除香波外不得用于三岁以下儿童使用的产品中，同时标签上必须标注“含水杨酸”，但很多添加水杨酸的祛痘类化妆品未按规定在标签上标识。

如采用现有标准体系检测上述禁限用物质，至少需要5种以上色谱系统，造成监管资源的巨大浪费。

本文建立了一种同时测定化妆品中上述12种化学成分的高效液相色谱方法，可满足化妆品监督检验的实际工作要求，大大提高了监管效能。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂
岛津LC 20－AT型高效液相色谱仪(配二极管阵列检测器);超纯水器;电子天平。

依
诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯、氯霉素、氯霉素二醇物、磺胺甲口恶唑、甲硝唑、替硝唑、水杨酸均来源于中国药品生物制品检定所。

乙腈为色谱纯，甲醇、磷酸、三乙胺、盐酸等其他试剂均为分析纯。

1.2 色谱条件
色谱柱:ACE C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流速:1.5 mL/min;柱温:40℃;进样量:20 μL;检测波长:210 nm(林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯)和277 nm(氯霉素、氯霉素二醇物、甲硝唑、替硝唑、依诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、磺胺甲口恶唑、水杨酸);流动相:乙腈(A)，0.025 mol/L磷酸三乙胺溶液(B，取1.54 mL
磷酸至930 mL水中，用三乙胺调至pH 5.5，加入70 mL乙腈，混匀)，梯度洗脱:0～10 min，100%～95%B;10～15 min，95%～93%B;15～22 min，93%～62%B;22～23 min，62%～100%B;23～32 min，保持100%B。

1.3 标准溶液的配制
分别准确称取12种标准品适量，用甲醇－0.1 mol/L盐酸混合溶液(体积比1∶1)
配制成质量浓度约为2 500 mg/L的标准储备溶液。

分别精密量取一定体积的氯霉素、氯霉素二醇物、甲硝唑、替硝唑、依诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、磺胺甲口恶唑、水杨酸标准储备溶液，用流动相B稀释配制成5、10、20、40、100、
200 mg/L的系列混合标准溶液Ⅰ。

分别精密量取一定体积的林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯标准储备溶液，用流动相B稀释配制成25、50、100、200、500、1 000 mg/L的系列混合标准溶液Ⅱ。

1.4 样品前处理
准确称取样品约1.0 g，置10 mL具塞比色管中，加甲醇与0.1 mol/L盐酸混合
溶液(体积比1∶1)至刻度，摇匀，超声提取20 min，必要时离心，取上清液经
0.45 μm滤膜过滤后供分析用。

若样品中待测成分的浓度超出线性范围的上限，
用流动相B为稀释溶剂进行适当稀释处理。

1.5 定性定量方法
采用与标准品色谱保留时间和紫外吸收光谱图比较的方式进行定性分析;取系列标
准溶液Ⅰ和Ⅱ分别进样，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归建立标准曲线，用外标法进行定量分析。

2 结果与讨论
2.1 实验条件的优化
2.1.1 提取溶剂的选择从溶解度上分析，氯霉素、氯霉素二醇物、水杨酸微溶于水，易溶于甲醇、乙醇;硝基咪唑类微溶于水和乙醇;喹诺酮类药物微溶于水和甲醇，易
溶于酸溶液或碱溶液;林可霉素类药物易溶于水或甲醇中;磺胺甲口恶唑在水中几乎
不溶，在稀酸溶液中易溶。

用水溶液作为提取溶剂时，氯霉素、氯霉素二醇物、磺胺类等成分的回收率较低;用纯甲醇或乙腈作为提取溶剂时，喹诺酮类成分的回收
率较低;比较发现，甲醇－0.1 mol/L盐酸(体积比1∶1)作为提取溶剂时，12种成
分的提取效率高，回收率稳定。

2.1.2 检测波长的选择从12种禁限用物质的紫外光谱图来看，氯霉素、氯霉素二
醇物的紫外吸收光谱相似，最大吸收波长在271～277 nm左右;依诺沙星、环丙
沙星和氧氟沙星的吸收光谱相似，最大波长在265～295 nm;甲硝唑和替硝唑的最大吸收波长均为319 nm;磺胺甲口恶唑和水杨酸的最大吸收波长分别为266 nm
和296 nm;林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯无紫外吸收特征，存在末端吸收。

综合考虑后选取277 nm作为氯霉素、氯霉素二醇物、甲硝唑、替硝唑、依
诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、磺胺甲口恶唑和水杨酸的检测波长，选择210 nm 作为林可霉素、克林霉素和克林霉素磷酸酯的检测波长。

2.1.3 流动相的选择12种成分中既有酸性化合物和碱性化合物，又有两性化合物，因此流动相pH值对分离效果的影响较大。

考察了流动相pH值为4.0～6.0时的
色谱行为，随着pH值增加，氯霉素二醇物、氧氟沙星、林可霉素、克林霉素和克
林霉素磷酸酯的保留时间明显增加，依诺沙星、环丙沙星和磺胺甲口恶唑的保留时间明显减少，甲硝唑、替硝唑、水杨酸和氯霉素的保留时间变化不大。

在pH 5.5时，各成分的分离效果最好。

2.1.4 柱温的选择分别考察了30、35、40、45℃柱温条件下12种成分的色谱行为。

实验结果表明，温度升高时，林可霉素、克林霉素和克林霉素磷酸酯的保留时间增加，其他成分的保留时间减少。

在40℃时各成分的分离效果最优。

2.2 方法的精密度与稳定性
分别吸取100 mg/L和500 mg/L的对照品溶液20 μL，在波长277 nm和210 nm分别平行测定6次，氯霉素二醇物、甲硝唑、替硝唑、水杨酸、氯霉素、依诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、磺胺甲口恶唑(100 mg/L)峰面积的相对标准偏差分
别为 0.6%、0.04%、0.1%、0.6%、0.03%、0.03%、0.5%、0.04%和0.6%，林可霉素、克林霉素和克林霉素磷酸酯(500 mg/L)峰面积的相对标准偏差分别为
0.2%、0.1%和0.5%。

分别吸取100 mg/L和500 mg/L的标准品溶液20 μL，于0、2、4、8、12、24 h时进样，氯霉素二醇物、甲硝唑、替硝唑、水杨酸、氯霉素、依诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、磺胺甲口恶唑(100 mg/L)峰面积的相对标准偏差分别为0.6%、0.1%、0.3%、1.9%、0.2%、0.2%、0.5%、0.2%和0.5%，林可霉素、克林霉素和克林霉素磷酸酯(500 mg/L)的相对标准偏差分别为0.2%、0.5%和1.7%。

表明样品溶液在24 h内稳定。

2.3 方法的线性关系、检出限与定量下限
取“1.3”配制的系列混合标准溶液，按上述方法测定，线性范围、回归方程及相
关系数见表1。

林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯3种成分在25～1 000
mg/L范围内线性关系良好，其他9种成分在5～200 mg/L范围内线性关系良好，相关系数均大于0.997。

在霜剂空白样品中加入一定量的对照品溶液，按S/N=3和S/N=10分别计算仪器检出限和定量下限，方法的检出限和定量下限结果见表1。

表1 12种禁限用成分的线性关系、检出限及定量下限Table 1 Linear ranges，regression equations，correlation coefficients(r)，limits of
detection(LODs)and limits of quantitation(LOQs)of 12 banned and restricted substances*y:peak area;x:concentration of
analyte(mg/L)Compound Linear range ρ/(mg·L－1) Regression equation* r LOD w/(μg·g－1)LOQ w/(μg·g－1)p-Nitropheny-2-amino-1.3-propanediol(氯霉素二醇物) 5～200 y=31 479x +53 125 0.997 7 5 15 Metronidazole(甲硝唑) 5～200 y=11 378x+54 148 0.998 3 15 45 Tindazole(替硝唑) 5～200 y=8 316.4x－2 326.7 1.000 0 15 45 Salicylic
acid(水杨酸) 5～200 y=9 100.3x+1 152.0 0.998 9 15 45 Chloramphenicol(氯霉素) 5～200 y=21 454x+93 310 0.998 3 5 15 Enoxacin(依诺沙星) 5～200
y=57 167x+25 768 0.997 2 5 15 Ciprofloxacin(环丙沙星) 5～200 y=85
289x+281 183 0.998 3 5 15 Ofloxacin(氧氟沙星) 5～200 y=35 181x+164 141 0.998 3 5 15 Sulfamethoxazole(磺胺甲口恶唑) 5～200 y=37 152x+11 315 0.997 5 5 15 Lincomycin(林可霉素) 25～1 000 y=4 761.9x－55 107 0.999 7 50 150 Clindamycin(克林霉素) 25～1 000 y=3 043.3x－7 344.9 0.999 7 50 150 Clindamycin phosphate(克林霉素磷酸酯) 25～1 000 y=1 862.2x －5 790.0 1.000 0 50 150
2.4 方法的回收率与相对标准偏差
取一批霜剂空白样品各1 g，分别做高、低两个浓度水平的加标回收实验，平行配制6份，按上述方法进行测定，结果见表2。

12种禁限用物质的平均回收率为88%～115%，RSD均小于5%，符合国家食品药品监督管理局发布的《化妆品及
其原料中禁限用物质检测方法验证技术规范》要求。

表2 12种禁限用成分在两种加标浓度下的回收率与相对标准偏差(n=6)Table 2 Recoveries and RSDs of 12 banned and restricted substances at two spiked levels(n=6)CompoundAdded m/μgAverage recovery珔R/%RSD sr /%p-Nitropheny-2-amino-1.3-propanediol 150，1 000 111，113 0.9，1.2 Metronidazole 150，1 000 93，111 1.3，2.3 Tindazole 150，1 000 88，90
0.5，1.7 Salicylic acid 150，1 000 88，114 0.7，1.5 Chloramphenicol 150，
1 000 91，111 1.8，1.9 Enoxacin 150，1 000 93，99 1.1，0.9 Ciprofloxacin 150，1 000 96，111 1.3，2.0 Ofloxacin 150，1 000 88，115 0.9，0.9 Sulfamethoxazole 150，1 000 96，109 3.0，0.9 Lincomycin 500，5 000 115，98 2.4，0.7 Clindamycin 500，5 000 111，106 0.4，0.6 Clindamycin phosphate 500，5 000 97，103 1.3，1.7
2.5 实际样品的测定
在优化条件下，标准品溶液的色谱图见图1，12种成分的色谱峰分离度均大于2.2，理论塔板数均大于6 650。

图1 12种禁限用物质混合标准溶液的色谱图(200 mg/L)Fig.1 Chromatograms
of the 12 mixed standard solutions(200 mg/L)1.p-nitropheny-2-amino-1.3-propanediol，2.metronidazole，3.salicylic acid，4.lincomycin，5.enoxacin，6.tindazole，7.ciprofloxacin，8.ofloxacin，9.sulfamethoxazole，
10.clindamycin phosphate，11.chloramphenicol，12.clindamycin
按上述方法，从商场收集133批化妆品，检出成分为甲硝唑、氯霉素、氯霉素二
醇物、磺胺甲口恶唑、林可霉素、氧氟沙星、依诺沙星、替硝唑，合格率为
91.7%;从网络收集228批化妆品，12种成分均有检出，合格率仅为58.7%。

在检出的12种非法添加化学成分中，依诺沙星、克林霉素磷酸酯、氯霉素二醇物、替
硝唑等为国内首次报道。

在不合格样品中，最常见剂型为膏霜剂，检出频率最高的成分为林可霉素、氧氟沙星和甲硝唑;混合添加占非法添加样品的65.1%，最常见添加方式为“硝基咪唑类+林可霉素类+喹诺酮类”。

同时混合添加各种药物引发的不良反应值得关注。

研究还发现大部分含有氯霉素的化妆品均同时检出含量较高的氯霉素二醇物，甚至发现只含氯霉素二醇物不含氯霉素的情况。

氯霉素二醇物是合成氯霉素的主要中间体或手性副产物，也是氯霉素降解后的杂质。

3 结论
本文建立了高效液相色谱法同时测定12种禁限用物质的检测方法，并发现了祛痘类化妆品中非法添加的多种新化学成分。

研究结果表明，该方法具有操作简便、回收率高、精密度好和灵敏度高等特点，为祛痘类化妆品中违法添加各种禁限用化学成分的监督检验提供了有力技术支撑。

建议有关部门加强祛痘类化妆品监管，尤其是网络销售的膏霜剂祛痘类化妆品质量安全应引起重视。

参考文献:
［1］Ministry of Health of the People s Republic of China.Hygienic Standard for Cosmetics(中华人民共和国卫生部.化妆品卫生规范)，2007. ［2］Xie Z J.Theories and Practices of Rapid Screening Technologies for Adulterations in Health Products.Guangzhou:South China University Technology Press(谢志洁.健康产品中非法添加化学成分快速筛查方法理论与实践.广州:华南理工大学出版社)，2011.
［3］GB/T 24800.6 －2009.Determination of 21 Sulfonamides in Cosmetics by High Performance Liquid Chromatography.National Standards of the People s Republic of China(化妆品中二十一种磺胺的测定高效液相色谱法.中华人民共和国国家标准).
［4］Wu D N，Zheng H H，Yang L H，Li J.Chin.J.Health Lab.Technol.(吴大南，郑和辉，杨丽华，李洁.中国卫生检验杂志)，2006，16(2):216－217.
［5］Yang Y W，Zhu Y.Chin.J.Health Lab.Technol.(杨艳伟，朱英.中国卫生检
验杂志)，2006，16(11):1343－1344.
［6］Yang Y W，Zhu Y，Zhang W Q，Yuan R.J.Environ.Health(杨艳伟，朱英，张卫强，袁韧.环境与健康杂志)，2006，23(3):264－266.
［7］Wang P，Li J，Zheng H H.Chin.J.Chromatogr.(王萍，李洁，郑和辉.色谱)，2007，25(5):743－746.
［8］Ma Q，Wang C，Wang X，Bai H，Dong Y Y，Wu T，Zhang Q，Wang J B，Tang Y Z.Chin.J.Anal.Chem.(马强，王超，王星，白桦，董益阳，武婷，张庆，王军兵，唐英章.分析化学)，2008，36(12):1683－1689.
［9］Zheng Y M，Guo X D，Xian Y P，Du Z F，Luo H Y，Wu Y L，Li H
Y.J.Instrum.Anal.(郑艳明，郭新东，冼燕萍，杜志峰，罗海英，吴玉銮，李慧勇.
分析测试学报)，2009，28(2):235－238.
［10］Luo L J，Yu X，Huang H.China Pharm.(罗丽娟，于晓，黄浩.中国药业)，2009，18(15):26－27.
［11］Liu H L，Li F，Yang R，Wang L H，Ma Y J.Chin.J.Chromatogr.(刘华良，李放，杨润，王联红，马永建.色谱)，2009，27(1):50－53.
［12］Liu H L，Yang R，Li F，Ma Y J.J.Environ.Health(刘华良，杨润，李放，马永建.环境与健康杂志)，2009，26(5):453－454.
［13］Zhao X Y，Li J，Lin Y F，Hu X Z，Wang P，Fu X F.J.Instrum.Anal.(赵
晓亚，李娟，林雁飞，胡小钟，王鹏，付晓芳.分析测试学报)，2009，
28(10):1138－1142.
［14］Jin W，Yang Y J，Wang W Y，Ye J N.Chromatographia，2009，
69(11/12):1221－1226.
［15］Huang W J，Jiang Z J，Hong J W，Zhao Y T.Guangzhou
Chem.Ind.(黄文静，蒋忠军，洪建文，赵艳婷.广州化工)，2010，38(6):150－151.
［16］Wu C S，Zhang J L，Qiao Y L，Wang Y L，Chen Z R.Chin.Chem.Lett.，2011，22(3):334 －337.。