小鼠海马神经元细胞的原代分离培养方法

小鼠海马神经元细胞的原代分离培养方法
1、培养板的包被
用0.01%的L-多聚赖氨酸溶液包被培养板和小玻片，37℃恒温孵育 4h 或常温过夜。

吸弃L-多聚赖氨酸溶液，灭菌去离子水漂洗培养孔及小玻片，晾干备用。

2、小鼠海马神经元细胞的分离及培养
（1）75%（体积分数）酒精消毒新生24h内的健康C57小鼠，在无菌条件下脱颈处死，剪开头皮及颅骨，取出脑组织，置于盛冷的pH7.2，无钙、镁的D-Hank's液的平皿中（下置冰袋）。

（2）无菌分离海马组织。

保持脑组织背面朝上，在镜下小心翻开大脑皮质，暴露海马，用眼科剪或尖镊分离海马周围组织，取出放入盛有D-Hank's液的平皿中。

（3）用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的组织块，0.125%胰蛋白酶消化，37℃作用 20min，期间振摇 2~3 次。

（4）弃去上清液，加入完全接种液终止消化，漂洗2次。

巴斯德吸管轻轻吹打 20次，制成细胞悬液，静置 2min。

（5）悬液收集于新的离心管，离心（1000rpm，10 min，4℃），弃去上清液。

加入完全培养液重悬，200 目不锈钢网过滤。

（6）将滤液进行台盼蓝拒染试验,血细胞计数板镜下计数。

以8.0 ×104至1.0 ×105/mL的密度将细胞以400µL/孔接种到预先用L-多聚赖氨酸包被的24孔培养板或100µL/孔接种 96 孔培养板。

（7）置37℃、5%CO2培养箱培养4-6h，全量更换为无血清培养液。

（8）体外培养第3d，加入Ara-C-工作液，以抑制非神经细胞过度增殖，作用 24 h后吸出。

（9）此后每3d半量换液1次, 体外培养第7～21d的细胞用于实验。