代谢调控发酵习题

代谢调控发酵习题
课件摘要
控制细胞膜渗透的⽅法
1、化学控制⽅法
通过控制发酵培养基中的化学成分，达到控制磷脂、细胞膜的形成或阻碍细胞壁正常的⽣物合成，使⾕氨酸向外渗透。

（1）控制磷脂合成，形成磷脂合成不⾜的细胞膜。

1）⽣物素缺陷型
作⽤机制：⽣物素作为关键酶⼄酰辅酶A羧化酶的辅酶，参与脂肪的合成，进⽽影响磷脂的合成。

控制的关键：⽣物素亚适量（5~10ug/l
2）添加表⾯活性剂（吐温60)或饱和脂肪酸
清除渗透障碍物，积累⾕氨酸。

3)油酸缺陷型由于油酸缺陷型突变株切断了油酸的后期合成，即丧失脂肪酸合成能
⼒，直接影响磷脂的合成和细胞膜的渗透性
控制关键：必须控制油酸亚适量
4)⽢油缺陷型
作⽤机制：丧失a-磷酸脱氢酶。

不能合成a-磷酸⽢油和磷脂。

必须由外界供给⽢油才能⽣长。

控制⽅法：⽢油限量供应（添加亚适量的⽢油或⽢油衍⽣物），间接控制磷脂合成。

（2）阻碍⾕氨酸菌细胞壁的合成，形成不完全细胞壁，进⽽导致形成不完全细胞膜。

像在对数⽣长期添加青霉素或头孢霉素C等抗⽣素抑制⾕氨酸⽣产菌细胞壁后期合成
乳糖操纵⼦：⼤肠杆菌（E.coli)的⼀种操纵⼦，由启动⼦(promoter,P)、活化蛋⽩结合位点(CAP)、操纵基因(operator,O )、及与乳糖代谢相关的⼏种酶的结构基因(structural gene)组成
调节酶包括3个种类：
⑴变构酶；
⑵同功酶：具有同⼀种酶的底物专⼀性，但分⼦结构不同；
⑶多功能酶：能够催化两种以上不同反应的酶。

反馈阻遏（feedback repression）是由代谢终点产物抑制酶
合成的负反馈作⽤。

3. 反馈抑制与反馈阻遏的⽐较
反馈抑制的效果⽐较直接⽽快速，因为不涉及蛋⽩质的合成过程，
当终产物浓度达到⼀定⽔平时，⽴即使酶的活⼒丧失，待最终产
物的浓度降低后，酶的活⼒⼜重新恢复。

反馈抑制作⽤不通过调节基因调节。

反馈抑制的物质基础是变构酶，通过酶的变构作⽤改变酶的活性。

变构酶的结构为基因所决定。

反馈阻遏是调节基因作⽤的结果，这是⽣物不通过基因⽽适
应于环境改变的⼀种“措施”，这种“措施”对于环境的改变反
应⽐较迟缓。

反馈阻遏是对酶合成的阻遏，所以效果不如反馈抑制那样迅
速，但可以节约原料，对⽣物有⼀定的优点。

1、⾕氨酸棒杆菌、黄⾊短杆菌等中的天冬氨酸族氨基酸的代谢调节机制
（1）天冬氨酸激酶是关键酶，受赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制。

（2）优先合成，蛋氨酸⽐苏氨酸、赖氨酸优先合成，苏氨酸⽐赖氨酸优先合成。

（3)代谢互锁在乳糖发酵短杆菌中，赖氨酸分⽀途径的初始酶⼆氢吡啶-2、
6-⼆羧酸合成酶受亮氨酸的反馈阻遏
（4）平衡合成，天冬氨酸和⼄酰CoA形成平衡，⼄酰CoA合成过量时，能解除天冬氨酸对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的反馈抑制。

（5）天冬氨酸与⾕氨酸之间的调节机制
⾕氨酸⽐天冬氨酸优先合成，⾕氨酸合成过量后，反馈抑制⾕氨酸脱氢酶使⽣物合成转向合成天冬氨酸。

苏氨酸发酵机制
根据天冬氨酸氨基酸的⽣物合成途径及代谢调节机制，⾸先要切断⽀路代谢，选育蛋氨酸缺陷型（met-),赖氨酸缺陷型（lys-),异亮氨酸缺陷型（ile-)的突变株，使天冬氨酸族氨基酸专⼀地转向苏氨酸；再选育抗苏氨酸结构类似物（如AHV,)抗赖氨酸结构类似物（AEC)等突变株，遗传性地解除苏氨酸对关键酶⾼丝氨酸脱氢酶的反馈调节及苏氨酸和赖氨酸对天冬氨酸激酶的协同反馈抑制；使苏氨酸得以⼤量⽣成和积累。

2、选育苏氨酸产⽣菌的⽅法
（1)切断或削弱枝路代谢
（！）切断或削弱蛋氨酸的合成⽀路
（！！）切断或削弱赖氨酸合成⽀路
（）切断苏氨酸到异亮氨酸的反应
（2）解除反馈控制
苏氨酸发酵不但要解除终产物对关键酶天冬氨酸激酶的反馈抑制，还必须解除终产物对⾼丝氨酸脱氢酶的反馈调节
（！）选育苏氨酸结构类似物抗性突变株
（！！）选育赖氨酸结构类似物抗性突变株。

（3）增加前体物天冬氨酸的合成
（！）强化CO2固定反应
选育⾼丝氨酸⾼产菌的⽅法
（1）切断⽀路代谢选育赖氨酸缺陷型（Lys-)突变株，使天冬氨酸全部⽣成⾼丝氨
酸，⽽不副产赖氨酸
（2）切断⾼丝氨酸向下反应的代谢
（！）选育苏氨酸缺陷型菌株（Thr-)
(!!)选育蛋氨酸缺陷型菌株（Met-)
（）选育⾼丝氨酸脱氨酶缺陷型菌株(HAD-)
(3)解除反馈调节
（！）解除苏氨酸和赖氨酸对关键酶天冬氨酸激酶的反馈控制
A选育赖氨酸结构类似物抗性突变株
B选育苏氨酸结构类似物抗性突变株
（！！）解除蛋氨酸对⾼丝氨酸脱氢酶的反馈阻遏，选育蛋氨酸结构类似物抗性突变株
（4）增加前体物的合成
2、蛋氨酸⾼产菌定向育种⽅法
1）解除反馈调节
（！）⾸先考虑解除蛋氨酸⾃⾝的反馈调节，主要通过选育抗蛋氨酸结构类似物突变株
（！！）选育SAM结构类似物抗性突变株
）解除苏氨酸和赖氨酸对天冬氨酸激酶的协同反馈抑制
（2）切断⽀路代谢
（！）切断或削弱苏氨酸的代谢⽀路
（！！）切断或削弱赖氨酸的代谢⽀路
（3）切断蛋氨酸向下反应的通路
（4)增加前体物的合成
⾼丝氨酸发酵⾼产⾼丝氨酸菌应具备的⽣化特征
（1）⼆氧化碳固定反应能⼒强。

（2)天冬氨酸合成能⼒强。

（3）天冬氨酸激酶活⼒强
（4）⾼丝氨酸脱氢酶活⼒强
（5）⼆氢吡啶-2、6 ⼆羧酸合成活⼒微弱或丧失。

（6）⾼丝氨酸-o转⼄酰酶丧失
（7）⾼丝氨酸激酶丧失
（8）⾕氨酸脱氢酶活⼒弱
渗漏型突变株
顾名思义，渗漏缺陷型就是指遗传性障碍不完全的缺陷型。

由于这种突变是它的某⼀种酶的活性下降⽽不是完全丧失，因此，渗漏缺陷型能够少量地合成某⼀代谢最终产物，能在基本培养基上进⾏少量的⽣长
代谢互锁Metabolic interlock
⼀种代谢产物的代谢调节，受来⾃另外⼀种从⽣物合成途径来看似乎完全⽆关的终产物的控制，这种现象叫代谢互锁
营养缺陷菌株的特点：
①需要添加缺失的该物质才能在基本培养基上⽣长；
②解除了该产物的反馈抑制或反馈阻遏；
③中间产物或另⼀分⽀途径的终产物得以积累；
④对某⼀的产物的积累，起到节约碳源的作⽤
⼀、渗漏突变株的应⽤
特点：
1 解除了反馈调节；
2 在基本培养基上⽣长；
3 积累其他分⽀途径的终产物。

优点：
在发酵过程中不需要添加营养缺失的物质。

浓缩营养缺陷型常⽤⽅法
（1）青霉素法：青霉素抑制G＋菌细胞壁的合成。

在基本培养基中野⽣型可以⽣长⽽被青霉素杀死，⽽缺陷型不⽣长，则不能被杀死。

（2）D－环丝氨酸法：原理同（1）
（3）五氯酚法：杀死发芽的孢⼦，不发芽的存活
（4）制霉菌素：杀死正在增殖的酵母细胞
（5）亚硫酸法：对发芽的霉菌孢⼦有杀灭作⽤
（6）2－脱氧葡萄糖：影响细胞壁的合成，杀死增殖的酵母
（7）过滤法：⽤于霉菌营养缺陷型的筛选。

孢⼦⼩，菌丝⼤。

（8）差别杀菌法：细菌的芽孢较营养体耐热。

80oC，15min即可杀死营养体。

⾕氨酸发酵的代谢途径
⾕氨酸发酵时，糖酵解经过EMP及HMP 两个途径进⾏。

⽣物素充⾜时，HMP 所占⽐例为38%；控制⽣物素亚适量，HMP所占⽐例26%，⽣成丙酮酸后，⼀部分氧化脱羧，⽣成⼄酰辅酶A，⼀部分固定CO2⽣成草酰⼄酸或苹果酸，草酰⼄酸与⼄酰辅酶A缩合成柠檬酸，再经下⾯的还原氨基化⽣成⾕氨酸
协同反馈抑制：变构酶（例黄⾊短杆菌、乳糖发酵短杆菌中AK）具有两个变构部位，可以与终产物结合，受终产物影响，当只有⼀种终产物与酶变构部位结合，酶活性不受影响，当有两种终产物同时过量存在，即两种终产物同时与酶两个变构部位结合时，酶的活性受到抑制，这种终产物的反馈抑制称为协同反馈抑制。

所谓脱敏就是使该酶抗反馈抑制和反馈阻遏。

AK只受Thr和Lys的协同反馈抑制作⽤，要解除该酶的反馈抑制作⽤，可以选⽤结构类似物抗性突变株。

赖氨酸结构类似的作⽤机制是起假反馈抑制作⽤，因其结构与赖氨酸相似，为天冬氨酸所误认，与苏氨酸⼀起在天冬氨酸激酶的变构部位上结合，协同抑制酶的活
性。

4、什么是原⽣质体融合技术？
5、菌种扩⼤培养的⽬的和意义是什么？
6、国内⾕氨酸发酵种⼦扩⼤培养普遍采⽤什么流程？
在⼈⼯条件下，使两种不同的微⽣物原⽣质体合并为⼀个完整细胞的技术，叫做原⽣质体融合技术
微⽣物原⽣质体：没有细胞壁的裸体微⽣物细胞
1.代谢⼯程指应⽤重组DNA技术和应⽤分析⽣物学相关的遗传学⼿段进⾏有精确⽬标的遗传操作，改变酶的功能或输送体系的功能，甚⾄产能系统的功能，以改进细胞某些⽅⾯的代谢活性的整套操作⼯作（包括代谢分析、代谢设计、遗传操作、⽬的代谢活性的实现）。

4.原⽣质融合指是⼀个⼈⼯实验系统，是将遗传性状不同的两个细胞融合，通过基因重组，形成具有新的、优良性状的新细胞的过程。

5.转导指利⽤转导噬菌体为媒介⽽将供体菌的部分DNA导⼊受体菌中，从⽽使受体菌获得部分遗传性状的现象。

6.代谢控制发酵：是指利⽤遗传学⽅法或其它⽣物化学⽅法，⼈为地在脱氧核苷酸（DNA）的分⼦⽔平上，改变和控制微⽣物的代谢，使有⽤⽬的产物⼤量⽣成、积累的发酵。

7.营养缺陷型：指原菌株由于发⽣基因突变，致使合成途径中某⼀步骤发⽣缺陷，从⽽丧失了合成某些物质的能⼒，必须在培养基中外源补加该营养物质才能⽣长的突变型菌株。

8.基因⼯程：基因⼯程是指重组DNA技术的产业化设计与应⽤，包括上游技术和下游技术两⼤组成部分。

上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；⽽下游技术则涉及到基因⼯程菌或细胞的⼤规模培养以及基因产物的分离纯化过程。

9.诱变：指利⽤物理或化学因素处理微⽣物细胞群体，促使其中少数细胞中的遗传物质(主要是DNA)的结构发⽣改变，从⽽引起微⽣物的遗传性状发⽣变化，然后通过⽬的选择标记设法从群体中筛选出少数性状优良的突变菌株的过程。

10.转化：指相当⼤的游离的供体细胞的DNA⽚段被直接吸收到受体细胞内，并整合于受体细胞的基因组中，从⽽使受体细胞获得供体细胞部分遗传性状的现象。

12.分⼦克隆：指对⽬的DNA分⼦进⾏切割，并连接到合适的载体上进⾏体外重组。

同⼯酶调节:同功酶是指能催化相同的⽣化反应，但酶蛋⽩分⼦结构有差异的⼀类酶，它们虽同存于⼀个个体或同⼀组织中，但在⽣理、免疫和理化特性上却存在着差别。

分解代谢物阻遏: 指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利⽤快的那种分解底物会阻遏利⽤慢的底物的有关酶合成的现象。

增效性反馈抑制: 两种末端产物同时存在时，共同的反馈抑制作⽤⼤于⼆者单独作⽤之和
结构类似物抗性突变株：所谓结构类似物抗性菌株，即是那些在含有类似物的环境中，其⽣长不被抑制的菌株，这种抗性菌株是由于变构酶结构基因或调节基因发⽣突变的结果，使结构类似物不能与结构发⽣了变化的阻遏蛋⽩或变构酶结合，细菌⽣长不受抑制，但合成终产物被抑制。

平衡合成: 经分⽀合成途径⽣成两种终产物EG，E和G取平衡合成。

E为优先合成，当E过剩时，E反馈抑制与优先合成途径有关的C到D酶，转⽽合成G，当G过剩时，可逆转E的反馈抑制，即E的反馈抑制被G所逆转，⼜转化优先合成E。

累积反馈抑制：每⼀分⽀途径末端产物按⼀定百分⽐单独抑制共同途径中前⾯的酶，所以当⼏种末端产物共同存在时它们的抑制作⽤是积累的，各末端产物之间既⽆协同效应，亦⽆拮抗作⽤
顺序反馈抑制：⼀种终产物的积累,导致前⼀中间产物的积累，通过后者反馈抑制合成途径关键酶的活性，使合成终⽌。

平衡合成：底物A经分⽀合成途径⽣成两种终产物E与G，由于a酶活性远⼤于酶b ,结果优先合成E。

E过量后就会抑制a酶，使代谢转向合成G。

G过量后，就会拮抗或逆转E的反馈抑制作⽤，结果代谢流⼜合成E，如此循环。

优先合成：底物A经分⽀合成途径⽣成两种终产物E与G，由于a酶活性远⼤于酶b ,结果优先合成E。

E过量后就会抑制a酶，使代谢转向合成G。

G合成达到⼀定浓度时就会对c酶产⽣抑制作⽤。

转导：利⽤转导噬菌体为媒介⽽将供体菌的部分DNA导⼊受体菌中，从⽽使受体菌获得部分遗传性状的现象。

基本培养基：能满⾜野⽣型或原养型菌株的最低营养成分的培养基。

代谢控制发酵：利⽤遗传学的⽅法或其他⽣物化学的⽅法，⼈为地在DNA分⼦⽔平上，改变和控制微⽣物的代谢，使有⽤⽬的产物⼤量⽣成、积累的发酵。

分解代谢物阻遏：当细胞具有⼀优先利⽤的底物时，很多其他分解反应途径受到阻遏。

代谢互锁：从⽣物合成途径来看，似乎是受⼀种完全⽆关的终产物控制，它只在较⾼浓度下发⽣，⽽且这种抑制作⽤是部分性的、不完全的。

组成酶与⽣长发育条件⽆关，常进⾏定量合成的酶，其存在不依微⽣物的代谢状态⽽转移。

协作反馈抑制当⼀条代谢途径中有两个以上终产物时，任何⼀个终产物都不能单独抑制途径第⼀个共同的酶反应，但当两者同时过剩时，他们协同抑制第⼀个酶反应。

转导转导作⽤就是利⽤转导噬菌体为媒介⽽将供体菌的部分DNA导⼊受体菌中，从⽽使受体菌获得部分遗传性状的现象。

：原⽣质体融合通过⼈为的⽅法，使遗传性状不同的两个细胞的原⽣质体进⾏融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组⼦的过程。

条件致死突变因环境条件的不同能显⽰野⽣型特性⼜能显⽰突变型特性的突变，称为条件致死突变。

即条件突变。

关键酶是参与代谢调节的酶的总称，作为⼀个反应链的限速因⼦，对整个反应起限速作⽤。

这些酶在代谢流的枢纽之处形成⽀
柱，不论对代谢流的质和量都起着制约的作⽤。

合作反馈抑制当任何⼀个终产物单独过剩时，只部分地反馈抑制第⼀个酶的活性，只有当两条⽀路的两个终产物同时过剩存在时，才能引起强烈抑制，其抑制程度⼤于各⾃单独存在的和。

转化转化就是指相当⼤的游离的供体细胞的DNA⽚段被直接吸收到受体细胞内，并整合于受体细胞的基因组中，从⽽使受体细胞获得供体细胞部分遗传性状的现象。

诱发突变利⽤物理或化学因素处理微⽣物细胞菌体，促使其中少数细胞中的遗
传物质（主要是DNA）的结构发⽣改变，从⽽引起微⽣物的遗传性状发⽣变化，然后通过⽬的选择标记法从群体中筛选出少数性状优良的突变菌株的过程。

第⼀章绪论
1、代谢控制发酵：就是利⽤遗传学的⽅法或其他⽣物化学⽅法，⼈为地在脱氧核糖核酸（DNA）的分⼦
⽔平上，改变和控制微⽣物的代谢，使有⽤⽬的产物⼤量⽣成、积累的发酵。

P2
2、代谢控制发酵的关键：取决于微⽣物代谢控制机制是否能够被解除，能否打破微⽣物正常的代谢调节，
⼈为地控制微⽣物的代谢。

P2
3、代谢⼯程的具体思路：P3
1、改变代谢流：
（1）、加速速度限制反应；（2）、改变分⽀代谢途径的流向；（3）、构建代谢旁路；（4）、改变能量代谢途径。

2、扩展代谢途径和构建新的代谢途径：
（1）、引⼊外源基因，延伸代谢途径；（2）、利⽤新的底物，构建新的⽣物合成途径。

第⼆章代谢控制发酵的基本思想
1、微⽣物细胞的调节机制：P7-9
（1）、通过控制基因的酶⽣物合成的控制机制：
①诱导——促进酶的合成；
②阻遏——抑制酶的合成，包括：
1）终产物阻遏，2）分解代谢物阻遏。

（2）、酶活性的控制机制：
①终产物抑制或激活，
②通过辅酶⽔平的活性调节，
③酶原的活化，
④潜在酶的活化。

（3）、通过细胞渗透性的控制：（根据酶在代谢调节中作⽤不同分类）
①调节酶：变构酶、同功酶、多功能酶。

②静态酶
③潜在酶
2、脱敏作⽤：变构酶经特定处理后，不丧失酶活性⽽失去对变构效应物的敏感性。

注：处理⽅法：①使变构酶解聚，②基因突变。

P15
3、反馈抑制的调节类型可以分为以下⼏种：P18-21 图略
（1）、单功能途径中酶活性的调节类型：①前体激活，②补偿性激活。

（2）、多功能途径中酶活性的调节类型：
①协作反馈抑制或称多价反馈抑制，
②合作反馈抑制，
③积累反馈抑制，
④顺序反馈抑制，
⑤假反馈抑制：指结构类似物的反馈抑制，
⑥同功酶
4、分解代谢物阻遏：当细胞具有⼀优先利⽤的底物（通常是，但并不总是葡萄糖）时，很多其他分解反应途径受到阻遏。

P27 (注：根据葡萄糖效应理解)
5、突破微⽣物的⾃我调节控制机制，使代谢产物⼤量积累的有效措施：P31
（1）、应⽤营养缺陷型菌株。

（2）、选育抗反馈调节的突变株。

（3）、选育细胞膜通透性突变株：使终产物在细胞内不能⼤量积累⽽引起反馈调节。

（4）、利⽤营养缺陷型回复突变株或条件突变株的⽅法，解除终产物对关键酶的调节。

（5）、应⽤遗传⼯程技术，创造理想的超微⽣物（构建⽬的⼯程菌株）。

（6）、发酵的环境条件的优化。

第三章代谢控制发酵育种的基本技术
1、诱变育种中的⼏个问题：P61-65
①出发菌株的选择：⑴出发菌株对诱变剂的效应，⑵染⾊体组倍数对诱变剂的效应。

②细胞悬浮液的制备：⑴同步培养，⑵菌龄，⑶细胞悬浮液浓度，⑷细胞悬浮液的制备。

③诱变剂的选择及处理⽅法的选择：⑴诱变剂的选择，⑵诱变剂量的选择，⑶诱变剂处理⽅法的选择。

④中间培养
注：为了达到淘汰野⽣型、浓缩缺陷型细胞的⽬的，不论应⽤上述哪⼀种⽅法，均需对诱变处理后经中间培养的培养物进⾏如下处理：①饥饿培养，②2倍氮源培养。

3、营养缺陷型菌株的检出⽅法：①逐个检出法，②夹层培养法，③限量补充法，④影印接种法p68
4、原⽣质体融合育种的⼀般步骤：P77
①标记菌株的筛选，
②原⽣质体的制备：影响因素：
⑴菌体的前处理，⑵菌体的培养时间（⼀般选择对数⽣长期的菌体），
⑶酶浓度，⑷酶解温度（⼀般控制在20-40℃），⑸酶解时间，⑹渗透压稳定剂。

③原⽣质体的再⽣，
④原⽣质体的融合，
⑤融合⼦的选择，
⑥实⽤性菌株的筛选。

5、转导：转导作⽤就是利⽤转导噬菌体为媒介⽽将供体菌的部分DNA导⼊受体菌中，从⽽使受体菌获得部分遗传性状的现象。

其中必须具有3个组成部分，即供体，转导噬菌体和受体。

P88
6、转化：转化就是指相当⼤的游离的供体细胞的DNA⽚段被直接吸收到受体细胞内，并整合于受体细胞的基因组中，从⽽使
受体细胞获得供体细胞部分遗传性状的现象。

包括3个步骤，即供体DNA的制备，受体细胞对DNA的吸收及转化⼦的选择。

P92
第七章糖代谢与控制
1、D-核糖发酵的代谢控制育种：图略（P248）
①出发菌株的选择，
②转酮酶缺陷突变株的分离：
⑴选育不利⽤D-葡萄糖酸或L-阿拉伯糖的突变株，
⑵选育莽草酸缺陷突变株，
⑶选育L-⾊氨酸缺陷、L-酪氨酸缺陷、L-苯丙氨酸缺陷、CoQ缺陷、维⽣素K缺陷或叶酸缺陷突变株。

③其他标记，
④利⽤基因⼯程技术构建核糖⼯程菌株，
⑤发酵控制。

2、γ-亚⿇酸发酵的代谢控制育种思路：图略P271-273
①出发菌株的选择，
②切断或减弱⽀路代谢，
③解除反馈调节，
④强化能量代谢，
⑤增强前体物的合成，
⑥选育Δ6-脱氢酶活⼒强的突变株，
⑦选育低温⽣长突变株，
⑧选育耐⾼糖的突变株。

第九章氨基酸的代谢控制与发酵
1、赖氨酸发酵：图略P292
①切断或减弱⽀路代谢，
②解除反馈调节，
③解除代谢互锁，
④改善膜的通透性，
⑤增加前体物的合成，
⑥选育温度敏感突变株，
⑦选育脲酶回复突变株，
⑧利⽤基因⼯程技术构建赖氨酸⼯程菌株。

2、⾊氨酸发酵：
①切断⽀路代谢，
②解除⾃⾝反馈调节，
③增加前体物，
④切断进⼀步代谢，
⑤利⽤基因⼯程技术构建⾊氨酸⼯程菌株，
⑥其他标记。

第⼗章核酸类物质的代谢控制与发酵
肌苷发酵的代谢控制育种：P366
①出发菌株的选择，
②增加前体物质，
③切断⽀路代谢：⑴选育Ade－菌株，⑵选育Xan－或Gu－菌株，⑶选育Thi－或His－菌株，⑷选育
核苷磷酸化酶弱的菌株。

④解除菌体⾃⾝的反馈调节：
⑴选育抗腺嘌呤及鸟嘌呤结构类似物突变株，如8-氮腺嘌呤、8-氮鸟嘌呤等抗性突变株，
⑵选育抗腺嘌呤或黄嘌呤的突变株，
⑶选育抗磺胺类药物突变株，如磺胺嘧啶、磺胺哒嗪抗性突变株。

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⼆、填空题
1、在脂肪酸β-氧化途径中，中间产物都是（1）辅酶A的衍⽣物，⽽在脂肪酸合成途径中的中间产物，
则都是（2）酰基载体蛋⽩的衍⽣物，这是脂肪酸分解与合成的根本性区别。

2、营养缺陷型菌株的筛选，⼀般分为（3）诱变处理、（4）中间培养、（5）淘汰野⽣型、（6）缺陷型的检出和鉴定等步骤。

3、获得有活⼒、去壁较为完全的原⽣质体是原⽣质体融合育种技术的先决条件。

在细菌和放线菌中，制备原⽣质体主要采⽤（7）溶菌酶；在酵母菌和霉菌中⼀般可⽤（8）蜗⽜酶和（9）纤维素酶等酶制剂。

5、TCA 循环的关键酶是（14）柠檬酸合成酶。

它催化（15）草酰⼄酸与（16）⼄酰CoA 合成柠檬酸的反应，该反应是TCA 循环中的限速反应。

6、⼄醛酸循环中的关键酶是（17）异柠檬酸裂解酶和（18）苹果酸合成酶。

7、⼄酰CoA 在脂肪酸合成中起着重要的作⽤。

在（19）线粒体内，由糖酵解产⽣的丙酮酸被氧化⽣成
（20）⼄酰CoA 。

脂肪酸的β-氧化作⽤在（21）线粒体中进⾏，⽽脂肪酸的合成却在（22）细胞质中进⾏。

因为脂肪酸合成所需要的碳源来⾃（21）⼄酰CoA ，⽽⼄酰CoA 不能透过（22）线粒体膜进⼊到
（23）细胞质中，所以从（24）线粒体向（25）细胞质供给⼄酰coA 的反应成为脂肪酸合成的前提条件。

2、在脂肪酸β-氧化过程中，所有反应并不是以游离型的脂肪酸进⾏的，⽽是带有（7） CoA 的脂酰CoA 的衍⽣物，即β-氧化过程中所有中间产物都是CoA 的衍⽣物。

催化这些反应的酶全部存在于（8）线粒体中。

β-氧化的重要作⽤之⼀，是⽣成（9）NADH+H +和（10） FADH 2，进⽽进⼊（11）呼吸链进⾏
（12）氧化磷酸化，参与⽣成ATP 。

3、⾕氨酸发酵是控制（13）磷脂合成代谢的典型例⼦，在⾕氨酸发酵过程中⼀般通过控制（14）⽣物素亚适量、添加吐温60或青霉素等⼿段来调节（15）细胞膜的渗透性，使细胞允许⾕氨酸从细胞内渗透到细胞外。

4、TCA 循环的速度取决于（16）柠檬酸合成酶酶促反应的速度，⽽这个酶促反应的速度⼜决定于（17）草酰⼄酸和（18）⼄酰CoA 这2个底物的浓度和（19）柠檬酸合成酶的活性。

5、⼄酰CoA 和草酰⼄酸在（20）线粒体内为柠檬酸合成酶所催化，合成柠檬酸。

柠檬酸可以⾃由地透过（21）线粒体膜，进⼊细胞质中，为（22）ATP-柠檬酸裂解酶催化分解，重新⽣成（23）⼄酰CoA ，参与（24）脂肪酸合成。

通过这个途径，由线粒体向细胞质供给的⼄酰基约占80%的⽐例。

此外，还有以（25）⼄酰⾁毒碱通过线粒体膜供给⼄酰基的⽅式。

1、已知在⼤肠杆菌中，cAMP 的胞内⽔平是由三种不同的过程决定的；cAMP 是通过（1）腺苷酸环化酶催化从ATP 合成
的，cAMP 可为（2）磷酸⼆酯酶所降解，cAMP （3）透过细胞膜分泌到外部介质⾥。

2、在微⽣物产量性状诱变育种中，诱变剂的作⽤，⼀是提⾼（4）突变频率，⼆是扩⼤（5）产量变异幅度，三是使（6）产量变异朝正向突变的⽅向移动。

4、酵母菌有性杂交的⽅法主要有（13）孢⼦杂交法、（14）群体交配法以及（15）单倍体细胞杂交法等三种。

6、⽣物体内⼤分⼦的核酸是由（20）单核苷酸作为原料聚合⽽成的。

这种原料的合成可以通过两条完全不同的途径来完成：（21）全合成途径，也称为“从⽆到有途径”，由（22）磷酸戊糖先同尚未完成的（23）嘌呤或嘧啶环结合，在这未完成的环上逐渐加上必要的部分，然后闭合成环。

（24）补救途径，也称分段合成，由⾷物中取得完整的嘌呤或嘧啶和戊糖、磷酸，通过酶的作⽤直接合成（25）单核苷酸。

4、什么是操纵⼦？主要包括那些基因？
所谓操纵⼦（元）是指结构上、功能上、协同作⽤的相关基因组成的⼀个⽚段（区域）。

操纵⼦假说认为：编码⼀系列功能相关的酶的基因在染⾊体中紧密排列在⼀起，且它们的表达与关闭是通过同⼀控制点协同进⾏的。

每个操纵⼦（元）⾄少由4个基因（部分）组成：（1）调节基因（R.I.C ）它能编码、调节（阻遏）蛋⽩，现发现有两种调节蛋⽩; (2)操纵基因：是操纵⼦中⼀个成员，它能控制决定蛋⽩质（酶）的氨基酸顺序的⼀整套结构基因的转录，⽽操纵基因可受调节基因产⽣的阻遏物所阻遏，许多情况下，单个操纵基因可以控制⼀个或多
个结构基因。

（3）结构基因：是指在操纵基因邻近（⼀般在下游处）存在⼀个或多个基因，
它编码不起调控转录作⽤的蛋⽩质，如酶、膜蛋⽩和核糖体等（4）启动基因：启动⼦（基因）
含有两个和RNA 多聚酶结合的顺序，⼀个集中在RNA 多聚酶起始位置前约10个碱基对，另⼀个则集中在这个位置前35个碱基对，当RNA 多聚酶与启动⼦接触并结合上去，mRNA 合成即开始。

5、什么是分解代谢物阻遏？其实质是什么？
D E B C F G C
指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利⽤快的那种分解底物会阻遏利⽤慢的有底物的关酶合成的现象。

分解代谢物的阻遏作⽤，并⾮由于快速利⽤的甲碳源本⾝直接作⽤的结果，⽽是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产⽣的中间代谢物所引起的阻遏作⽤。

因此，分解代谢物的阻遏作⽤，就是指代谢反应链中，某些中间代谢物或末端代谢物的过量累积⽽阻遏代谢途径中⼀些酶合成的现象。

分解代谢物阻遏的实质是由于细胞内缺少了环腺苷酸（cAMP）。

6、cAMP是怎样控制酶合成的⽔平呢？
1）Lac.opern中的启动基因P包含两个位点：A，与CRP基因编码的⼀种调节蛋⽩，称cAMP 受体蛋⽩简称CRP或CAP结合点。

B，和RNA多聚酶结合的位点。

2)转录开始时，cAMP先与CAP或结合⽣成cAMP-CAP复合物。

3) CAP-cAMP复合物再与Lac.opern中的启动基因P 的CAP结合位点结合，从⽽激活了位点，进⽽促进RNA多聚酶与它的结合位点结合，使转录启动（注意CRP起正的作⽤），所以解除了分解代谢物的阻遏。

4）RNA多聚酶进⼊RNA 多聚酶位点向前漂移5）当有诱导物存在时，RNA多聚酶进⼊操纵基因O位点内的转录起始点6）cAMP在乳糖操纵⼦转录中是通过CAP-cAMP复合物与DNA结合时促进转录的，这种调控是正调控。

（7）细胞内cAMP⽔平在某些⽅向反映出细胞内能量的状态
A TP cAMP AMP; cAMP⽔平与腺苷酸环化酶和磷酸⼆酯酶的相对活性有关。

若CRP基因失活的突变株就不能诱导任何分解代谢物阻遏系统酶的合成，因⽽只能在易被利⽤的基质上⽣长。

若腺苷酸环化酶丧失的突变株，那么cAMP⽔平下降，那么就不能在受阻遏的碳源（如⽢油、乳糖、蔗糖）等上⽣长，但它和CRP缺陷突变株不同，外源加⼊cAMP还是有效的
1．请总结⿊曲霉柠檬酸产⽣菌的柠檬酸发酵机制（15分）
葡萄糖发酵⽣成柠檬酸的理想途径是：1mol的葡萄糖经糖酵解途径转变为⼆摩尔丙酮酸，其中1mol丙酮酸通过丙酮酸脱氢酶（PDH）脱氢脱CO2⽣成⼄酰辅酶A，另⼀摩尔丙酮酸在丙酮酸羧化酶（PC）的CO2固定反应⽣成草酰⼄酸，进⽽⽣成苹果酸；⼄酰辅酶A与苹果酸进⼊线粒体内，苹果酸再⽣成草酰⼄酸，通过线粒体内的柠檬酸合成酶（CS）的缩合作⽤下，⽣成柠檬酸。

C6H12O6 + 1.5O2→C6H8O7 + 2H2O
在碳平衡⽅⾯没有碳原⼦的损失，在⼄酰辅酶A与草酰⼄酸缩合时还从⽔中引进⼀个氧原⼦，对糖的转化率为106.7%
⿊曲霉柠檬酸产⽣菌积累和⽣成柠檬酸的发酵机制主要有：
①由于严格限制供给锰离⼦（激活剂），从⽽解除了柠檬酸和A TP对PFK酶的反馈抑制，使EMP途径的代谢流增⼤。

（Mn2+↓→HMP↓→合成蛋⽩(核酸)↓→NH4+↑→PFK↑→柠檬酸）；。