外湿对正常小鼠过氧化与抗氧化影响的实验研究_赵丽

第11卷 第4期 2009 年 4 月
辽宁中医药大学学报
JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCM
Vol. 11No. 4
Apr . ，2009
目前，关于湿邪致病机理的一些研究表明[1]：湿证可导致机体免疫调节功能紊乱、营养吸收障碍以及能量代谢不足等。

1 材料与方法
1.1实验动物与分组 实验选用昆明系健康雄性小白鼠40只，将其随机编号称重，分为两组，即正常对照组（A组）20只，外湿组（B组）20只。

正常对照组不施加任何处理因素。

造模第10天，将A组、B组小鼠全部处死，取全肝。

1.2实验各组的制作 动物实验室通风、采光条件良好。

实验动物分组后，单笼饲养，自由取食水，同等条件下饲养3天，从第4天起施加处理因素。

造模阶段时处长夏季节，外湿造模持续共10天，具体方法如下：A组不施加任何处理因素。

B组置温度为18~25℃，相对湿度RH>90%的造模箱中，造模箱由3mm厚的有机玻璃制成，体积为0.5m×0.3m×0.3m，箱上开有通气孔，箱内放温湿度计，箱底为钢丝网架，网架下设有水槽。

1.3脂质过氧化物和相关抗氧化酶的测定 丙二醛(malondialdehyde,MDA) 据Ohkawa H法[2]。

共轭双烯(Conjugated dienes,CD) 据Pryor WA and Castle L法[3]。

过氧化氢酶(Catalase,Cat) 据Sinha AK法[4]。

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD) 据Makarevich OP and Gdikovl PP法[5]。

过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px) 据Austin L法[6]。

1.4数据统计方法 应用Excel97软件进行数据分析，并用华西医科大学医学软件包PEMS进一步复核。

2 结果与分析
2.1外湿造模阶段小鼠一般状态的观察 第1天，实验各组小鼠较以前无明显改变；第2天，B组有5只小鼠出现眯眼现象，但可经轻度刺激后迅速恢复，大便无特殊改变，呈扁椭圆形，颜色偏黑；第4天，B 组在钳捉状态下机警度下降，有3只小鼠出现懒动，扎堆现象，经震荡刺激后可恢复，食量减少，大便无明显改变；第6天，B组小鼠均出现懒动，扎堆现象，经震荡刺激后有7只小鼠无反应，背毛散乱无光泽，有2只小鼠出现肢伸不收现象；第8天，B组在原有症状基础上出现了稀便，颜色较黑；第10天，B组小鼠出现了肛周秽浊现象。

2.2外湿造模阶段小鼠肛温 体重的测量 见表1。

表1 实验各组处理前后肛温 体重差数均值
比较统计表（n=10，x—±s）
组别 肛温（℃） 体重（ｇ）
Ａ组 0.02±0.569 3.785±0.8041 Ｂ组 0.75±0.596* -1.06±0.9577*注：B组与Ａ组比较，*P<0.01。

-为处理后较处理前均值减少。

外湿对正常小鼠过氧化与抗氧化影响的实验研究
赵 丽，刘 波，张效莉
（辽宁中医药大学职业技术学院，辽宁 沈阳 110101）
摘 要：目的：探讨单纯环境因素─外湿对正常小鼠生物膜结构和功能改变的规律及其机制，从分子生物学角度揭示湿邪作用机体产生损伤的机理。

方法：对模拟潮湿环境因素研制的外湿小鼠模型与正常小鼠在机体过氧化与抗氧化方面进行了比较研究。

结果：外湿模型小鼠出现了体重的下降，丙二醛（malondialdehyde，MDA）和共轭双烯（conjugated dienes，CD）指标的升高，过氧化氢酶（Catalase，Cat）、超氧化物歧化酶（superoxid dismutase，SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxide，GSH-Px）指标的下降，说明外湿模型小鼠出现了脂质过氧化损伤和抗氧化酶活性的下降。

结论：外湿可以 导致机体脂质过氧化损伤和抗氧化酶活性下降。

关键词：外湿；动物模型；脂质过氧化；抗氧化酶
中图分类号：R-332文献标识码：B文章编号：1673-842X (2009)04- 0211- 02
Experimental Study of the Peroxidation-antioxidation Effect of Exopathic Dampness on Normal Mice
ZHAO Li,LIU Bo,ZHANG Xiao-li
（Vocational Technical College,Liaoning University of Traditional
Chinese Medicine,Shenyang 110101,Liaoning,China）
Abstract：This experiment is a comparative study on the mice with exopathic dampness modeled and normal mice on bodies' change of peroxidation-antioxidation. The experiment aims to approach the laws and mechanisms of the change of the structure and function of the biomembrane in normal mice modeled through single circumstances factor:exopathic dampness,reveal that dampness damage organism after it invaded. The results show that the group of exopathic dampness have the decrease of body weight, the increase of the contents of malondialdehyde (MDA) and conjugated dienes (CD), the decrease of the activity of catalase (Cat), superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px). Explaining the group of exopathic dampness has the impairing lipid peroxidation and the decreasing of antioxidant enzyme, which indicates the factor of exopathic dampness can result in the impairing lipid peroxidation and the decreasing of antioxidant enzyme.
Key words：exopathic dampness; animal model; lipid peroxidation; antioxidant enzyme
收稿日期：2008-12-19
作者简介：赵丽（1975-），女（满族），辽宁北镇人，讲师，硕士，研究方向：藏象本质及其应用研究。

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辽宁中医药大学学报11卷
原始数据经方差齐性检验和t检验处理后，从表1可以得出：①A组体重明显升高，而模型组出现了体重下降，与A组比较具有显著性差异；②A组出现了肛温轻微波动，B组肛温升高，B组与A组比较具有显著性差异。

2.3外湿造模阶段小鼠脂质过氧化物含量和相关抗氧化酶活性的测定 见表2。

原始数据经方差齐性检验和t检验处理后，从
表2 实验各组脂质过氧化物含量和相关抗氧化酶活性均值比较统计表（n=10，x—±s）
组别 CD（μmol/mg） MDA（μmol/mg） Cat（U/g） SOD（U/mg） GSH-Px（U/mg） A组 2.8385±0.5791 10.4796±1.7200 34.125±4.7685 5.234±0.4888 55.828±4.1783 B组 3.546±0.5196* 13.1752±1.3202* 23.6832±2.6812* 4.496±0.489* 45.733±3.6593*注：B组与A组比较，*P<0.01。

表2可以得出：外湿模型组出现了CD、MDA两项指标的升高，与A组比较具有显著性差异。

以上结果表明，模拟潮湿环境因素塑造的外湿小鼠模型出现脂质过氧化物含量的升高及相关抗氧化酶活性的降低。

3 讨 论
自由基是机体生化反应中产生的性质活泼、具有极强氧化能力的原子或原子团。

自由基是机体正常代谢的中间产物，对机体是有利的，自由基一旦产生立即和周围的物质进行反应，本身消失又产生新的自由基。

在正常情况下，机体内的自由基生成与消除处于平衡状态。

但自由基[如超氧阴离子自由基（02-）、羟自由基（·OH）、过氧化氢（H2O2）等]过多或清除自由基的防御体系[包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（Cat）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、维生素E、维生素B等]发生障碍，自由基在体内积聚，就会引起生物大分子如脂质、蛋白质、核酸的损伤，导致细胞结构的破坏和机体的衰老。

脂质过氧化作用（LPO）是指在多不饱和脂肪酸（PUFA）中发生的一系列自由基反应，它以链式和链式支链反应的形式不断地形成脂质过氧化物（LOOH）。

BD是脂肪酸自由基进行双键重排的产物。

MDA是LOOH的裂解产物，它可与含有游离氨基的蛋白质、磷脂酰乙醇胺及核酸等进行多次交联，连接成比原来大许多倍的大分子，致使膜蛋白变性，膜酶失活，膜受体失效，出现膜结构的破坏，膜流动性的下降，膜脆性和通透性的增加，导致生物膜结构和功能的异常，影响机体的物质代谢、能量代谢和信息传递，从而危及了正常的生命活动。

Cat又称触酶，是由四个相同亚单位组成的四聚体酶。

此酶在细胞内主要与线粒体及过氧体相结合，与产生过氧化氢的需氧脱氢酶（氨基酸氧化酶等）同时存在，能及时有效地消除过氧化氢的有害作用。

在不能清除低浓度的过氧化氢时，常以过氧化氢酶与过氧化氢复合物的形式存在于细胞内。

SOD能催化超氧阴离子自由基的歧化反应，阻止由自由基引发的脂质过氧化作用所造成的细胞损伤。

GSH-Px的亚细胞分布主要是在细胞的胞液和线粒体基质中，能将体内产生的过氧化氢和过氧化脂质迅速分解成水和醇。

反应过程中以还原型谷胱甘肽作为供氢体，并通过硒与底物形成中间复合体。

本实验模拟潮湿环境塑造外湿动物模型，方法经参考文献[7-8]并加以改进。

造模阶段处于长夏季节，将B组小鼠置于造模箱中，造模箱内相对湿度（RH）在90％以上，使小鼠生活在氤氲熏蒸，水气上腾，潮湿充斥的环境中。

B组小鼠出现了肛周秽浊，嗜卧，懒动神疲，肢伸不收等外湿侵袭的症状。

此外，B组还出现了肛温升高的症状，说明外湿动物模型处于低热状态，这与湿郁发热的理论相符。

故可以判断外湿造模阶段，B组出现的是外湿模型。

吴丽丽等[9]研究表明：湿证致病组大鼠SOD活性下降，MDA含量升高。

本实验模拟潮湿环境因素塑造的外湿动物模型（B组）出现了CD、MDA含量的升高及SOD、Cat、GSH-Px活性的降低，再一次证明了湿邪致病导致体内过氧化物含量升高，相关抗氧化酶活性降低，揭示湿邪致病过程中，机体抗氧化能力下降，存在自由基损伤。

张六通等[10]研究发现外湿大鼠模型大小肠黏摸发生慢性炎性改变。

吴丽丽等[9]研究表明，湿邪致病的大鼠胃、小肠、肝、肺、肾等都出现了不同程度的病理形态学的改变，且都是以渗出、变性、坏死的炎性改变为主，尤其以胃与小肠的损伤最为严重。

笔者进一步分析其机理，认为白细胞在病原微生物的刺激下，通过NADPH氧化途径，产生“呼吸爆发”，释放大量超氧阴离子自由基来杀死病毒、细菌，体内产生的超氧阴离子自由基远远超过了抗氧化酶系统的清除能力；而且积累过剩的氧自由基会进一步与线粒体内外膜上的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，导致生物膜结构和功能的改变。

因此，氧自由基的代谢失衡是湿邪致病的关键。

本实验采用模拟潮湿环境因素塑造了外湿动物模型组（B组），实验结果表明：外湿模型动物出现了CD、MDA含量的升高及SOD、Cat、GSH-Px活性的降低，说明外湿证存在体内过氧化与抗氧化之间的平衡失调，其根源均在于氧自由基的生成与氧自由基的清除之间的失衡，造成小鼠的脂质过氧化损伤。

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参考文献
[ 1 ] 严灿. 湿阻证患者免疫调节功能的临床观察及其机理探讨[ J ] . 中国中医基础医学杂志，1998，4 ( 6 )：38.
[ 2 ] Ohkawa H. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobar - bituric acid reaction [ J ] .Anal Biochem，1979，95：351.
[ 3 ] Pryor WA，Castle L.Methods in enzymology [ M ] . New York:Aca- demic press，1984：293.
[ 4 ] Sinha AK.Colorimetric assay of catalase [ J ] .Anal Biochem，1972， 47：389.
[ 5 ] Makarevich OP，Golikool PP.Superoxide dismutase activity in pa- tients during acute periods of various diseases [ J ] . Lab Delo，1983， 6：24.
[ 6 ] Austin L. Determination of glutathione reductase and glutathione peroxidase [ J ] . Anal Biochem，1988，174：575.
[ 7 ] 陈孝银. 湿阻证大鼠胃肠功能的改变及健脾祛湿方药的影响 [ J ] .四川中医，1999，17 ( 1 )：4.
[ 8 ] 王昕. 伤湿所致大白鼠脾阳虚证动物模型及其机理研究[ J ] . 辽宁中医杂志，1995，22 ( 4 )：187.
[ 9 ] 吴丽丽. 自由基损伤与湿邪致病机理的探讨[ J ] .江西中医学 院学报，2001，13 ( 1 )：20.
[ 10 ] 张六通. 外湿大鼠关节、肺、大小肠和肝病理学研究[ J ] .中国 中医基础医学杂志，1996，2 ( 3 )：35.
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