实验五 多酚氧化酶的制备和性质研究

实验五多酚氧化酶的制备和性质研究
一、目的
⒈学习从组织细胞中制备酶的一般方法
⒉学习多酚氧化酶的作用特性及影响多酚氧化酶作用的因素
二、原理
多氧化物酶是一种含铜的酶，广泛存在于各种组织如鲜蘑菇、土豆和水果中。

土豆、水果去皮后表面变成褐色就是由于该酶作用的结果。

由多酚氧化酶催化的反应（以邻苯二酚为例）可用下式表示：
多酚氧化酶作用的最适pH为6～7，最适底物是邻苯二酚（儿茶酚）；间苯二酚和对苯二酚与邻苯二酚的结构相似，他们也可被氧化为相应的醌类化合物。

因此，由多酚氧化酶催化的氧化还原反应可通过溶液颜色的变化鉴定。

细胞环境中的各种因素直接影响酶的催化活性，因为酶是生物催化剂。

要研究某一种因素对于酶催化反应的影响时，仅在被研究的因素呈变化的情况下，测定它对于反应速度的影响，而其他的实验条件应保持一致。

三、材料
1）土豆
2）高速组织捣碎机
3）烧杯（100mL）
4）平纹布或纱布
5）试管及试管架
6）恒温水浴
7）小刀
8）移液管（2mL、5mL、10mL）
四、试剂
⑴0.1mol/L的氟化钠（NaF）溶液：把4.2gNaF溶于1000mL水中。

⑵0.01mol/L的邻苯二酚溶液：将1.1g邻苯二酚溶解于1000mL水中，用1％的氢氧化钠调节溶液的pH为6.0 。

新鲜配制，并储存于棕色瓶中。

⑶柠檬酸缓冲液（0.05mol/L,Ph4.8）
⑷5%的三氯乙酸溶液
⑸苯硫脲（结晶）
⑹0.01mol/L的间苯二酚溶液
⑺0.01mol/L的对苯二酚溶液
⑻饱和硫酸铵溶液
⑼0.96％的盐酸：把9.6mL浓盐酸加水稀释至1L
⑽0.1%的乳酸溶液（100mL水中含有0.1mL的乳酸）
⑾0.5％的碳酸钠溶液
⑿0.01％的碳酸钠溶液
五、操作步骤
⒈多酚氧化酶的制备
⑴拿一块土豆，洗去上面的泥土
⑵把土豆削皮后切成小块
⑶称取100g小块土豆，立即加入氟化钠溶液100mL，放入组织捣碎机中研磨30s，（此步最好6个同学一起做，上述用量乘6）
⑷把匀浆物通过几层纱布过滤
⑸取50mL滤液（注：滤液应无色，若为红色应重新匀浆提取），加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混合后于4℃放置30min，可见有白色沉淀产生。

⑹将上层清夜倒出一部分（若离心管容量允许，可不必倒出部分上清），其余部分在4000r/min下离心15min，倒掉上清，保留沉淀物。

⑺将沉淀物用大约20mL柠檬酸缓冲液溶解，在4000r/min下离心20min，上清即为酶提取液。

⒉多酚氧化酶的作用
⑴将三支干净的试管，分别编号为1、2和3
⑵按下面的要求制备各管
管1：加15滴酶抽提液和15滴0.01mol/L的邻苯二酚溶液，混合均匀
管2：加入15滴酶抽提液和15滴水，混合均匀
管3：加入15滴0.01mol/L的邻苯二酚溶液、15滴水，混合均匀
⑶把三支试管放于37℃水浴上，每隔5in振荡试管，并观察每管中溶液颜色的变化，记录入下表，共反应25min。

表 12 三管反应比较
⒊多酚氧化酶的化学性质
⑴取三支试管，分别编号为1、2和3
⑵向管1中加入15滴酶抽提液和15滴0.01mol/L的邻苯二酚溶液，振荡混合放于37℃水浴中10min
⑶向管2中加入15滴酶抽提液和10滴5％的三氯乙酸，混合均匀，放置2min，再加入15滴0.01mol/L的邻苯二酚溶液。

混合均匀放于37℃水浴中10min，观察颜色变化。

⑷向管3中加入15滴酶抽提液和少量苯硫脲结晶，充分混合，再加入15滴邻苯二酚溶液。

将试管放入37℃水浴中10min，观察溶液颜色的变化。

⒋底物专一性
⑴取三支试管，分别编号1、2和3
⑵向三支试管中分别加入15滴酶抽提液
⑶向管1中加入15滴0.01mol/L的邻苯二酚溶液，向管2中加入15滴0.01mol/L的间苯二酚溶液，向管3中加入15滴0.01mol/L的对苯二酚溶液。

⑷混合各试管中的溶液，把三支试管都放于37℃水浴中。

⑸以5min的时间间隔，观察溶液的颜色变化，共保温15min，使用符号“＋”“＋＋”……表示每管中溶液的颜色深浅，即表示酶的活性。

⑹多酚氧化酶的最适底物是哪一个？
表13 多酚氧化酶最适底物的判断
⒌底物浓度
⑴取三支试管，分别编号为1、2和
3
⑵向管1中加入0.1mL0.01mol/L的
邻苯二酚溶液和3.9mL的水，混合
⑶向管2中加入1.0mL0.01mol/L的邻苯二酚溶液和3mL水，混合
⑷向管3中加入4mL0.01mol/L的邻苯二酚
⑸向三支试管中分别加入0.5mL酶抽提液，混合
⑹把三支试管放于37℃水浴中保温1min，记录观察到的结果
⒍酶浓度的影响
⑴取2支试管，分别编号为1和2
⑵向管1中加入15滴0.01mol/L的邻苯二酚和15滴酶抽提液，混合
⑶向管2中加入15滴0.01mol/L的邻苯二酚和1滴酶抽提液，14滴水，混合
⑷把两支试管放于37℃水浴中保温2min，观察每管中溶液颜色的变化。

⒎氢离子浓度
⑴取5支试管，分别编号1、2、3、4和5
⑵向管1中加入2mL0.96％的盐酸，向管2中加入2mL0.1％的乳酸；向管3中加入2mL蒸馏水，向管4中加入2mL0.01％的碳酸钠溶液，向管5中加入2mL0.5％的碳酸钠溶液。

每管的pH应分别为1、3、5、7和9。

⑶向5支试管中分别加入15滴0.01mol/L的邻苯二酚溶液和15滴酶液。

⑷混合各管内容物，把各管放入37℃水浴中保温5min，观察每管中溶液的颜色变化并确定
多酚氧化酶作用的最适pH。

六、思考题
⒈向多酚氧化酶溶液中加入苯硫脲，再加入其底物，为什么溶液的颜色不变化？
⒉为什么土豆及苹果等去皮后表面变成褐色？
⒊为从组织细胞中获得酶的粗提纯样品常用哪些方法？
⒋欲获得有活性的酶应注意哪些因素？
⒌为什么用氟化钠作为抽提溶剂？
⒍多酚氧化酶的最适温度、最适pH是多少？。