力则是对益生菌菌株的开发。在对益...

中文摘要
中文摘要
作为益生菌产业中的重要研究内容,针对益生菌候选菌株筛选及鉴定方法的
研究一直受到研究者们的关注。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析法是近
■
年发展起来的,基于菌株特征性蛋白指纹图谱实现菌株鉴定的新型微生物鉴定方
法,其方法除具有鉴定准确、快速等优点外,还具备可高通量鉴定被检菌株等特
点,其方法的适用性及实用性正被研究者们广泛而深入的研究。

..妒
本文通过对基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析法检测及鉴定常见益
生菌过程中不同的分析方式、不同的基质、不同的基质溶剂、不同的菌体处理溶
剂、不同的点样方式及不同的点样比例等主要影响因素进行考察,首次建立了基
质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析法检测及鉴定常见益生菌的最佳实验方
法。

另外,基质辅助激光解吸电离飞行时问质谱分析法所得鉴定结果被证明具有
较高的稳定性及较好的重复性且当菌落总数在以上时被检菌株均能够被
‘。

正确地鉴定到种水平。

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此外,以传统表型鉴定方法及序列同源性分析鉴定方法为对比方
法,对基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析法检测及鉴定常见益生菌的实用
性进行考察发现,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析法具备对常见益生菌
在属、种、亚种及菌株水平上进行鉴定的能力且此方法鉴定准确、快速、操作简
易、廉价、可对被检菌株进行高通量鉴定,展现出了此方法良好的应用前景。

关键词:基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析法;传统表型鉴定;
序列同源性分析;菌种鉴定;益生菌;
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..益生菌概念变化的历史?。

..益生菌的益生功能?
..益生菌的种类??..
.乳酸菌的概述?.
..乳酸菌与益生菌之间的关系及乳酸菌的定义?。

..乳酸菌的种类??一
.乳酸菌的鉴定?..
..乳酸菌的传统表型鉴定方法??..
..乳酸菌的分子生物学鉴定方法?..
. .
技术在细菌检测及鉴定中的应用?
..质谱用于微生物检测及鉴定的发展历史..
.
.. 的工作原理??..
.. .
技术用于细菌鉴定的研究进展
.课题研究的意义和内容
..课题研究的意义?
..课题研究的内容?
第章供试菌株的筛选.前言?..
.实验材料
..供试菌株?
..主要试剂及来源?
..主要仪器设备及来源..主要试剂的配制?
.实验方法黑龙江大学硕士学位论文
..供试菌株的分离与纯化?
..供试菌株的生理生化试验.
..供试菌株的
序列同源性分析.
.结果与讨论
..益生菌候选菌株的分离纯化结果
..供试菌株的生理生化试验
..供试菌株的序列同源性分析结果?.
.本章小结
第章
技术检测及鉴定常见益生菌最佳实验方法的建立? .前言.实验材料
..供试菌株?.
..主要试剂及来源?
..主要仪器设备及来源
.
..主要试剂的配制.实验方法
..供试菌株的培养?
..代表菌株的准备?
..分析方式的选择?..
..基质的选择.
..基质溶剂的选择?.
..菌体处理溶剂的选择..溶剂处理辅助方法的选择
..点样方式的选择?..
..点样比例的选择?
.. .
分析..鉴定结果的稳定性考察?
..鉴定结果的重复性考察..
..检测灵敏度的考察??..目录
.. .
技术适用性的初步研究??..
.结果与讨论..离子峰质量范围的选取?
..分析方式的确定?.
..基质的确定
..基质溶剂的确定?
..菌体处理溶剂的确定..溶剂处理辅助方法的确定..
..点样方式的确定?.
..点样比例的确定?.
..鉴定结果的稳定性考察结果..鉴定结果的重复性考察结果?.. ..检测灵敏度的考察结果?
.. . 技术适用性的初步研究结果。

.本章小结
第章技术检测及鉴定常见益生菌的实用性研究?
.前言??.
.实验材料
..供试菌株?.
..主要试剂?一
..主要仪器设备..主要试剂的配制?
.实验方法
..供试菌株的. 分析
.. .
分析??.
..
基因序列聚类分析图的构建?
.结果与讨论...
分析与序列同源性分析鉴定能力的比较.
..?
技术与常用鉴定方法实用性的比较?.
..黑龙江大学硕士学位论文
.本章小结
结
论....
参考文献??。

附录??..
致射?.
攻读学位期间发表的学术论文及已申请的发明专利??.
独创性声明?.
学位论文版权使用授权书?.第章绪论
第章绪论
.益生菌
..益生菌概念变化的历史
世界各地人们食用酸奶、干酪及腌制蔬菜等含益生菌发酵食品的传统由来已
久,但针对益生菌营养价值及保健功能的认知和研究还是近世纪的事情。

在
世纪初期,诺贝尔奖获得者俄国科学家梅契尼科夫为了研究人类长寿问题专程到
保加利亚进行调查发现,这里的百岁长寿老人都爱喝酸奶。

梅契尼科夫对这些酸
奶化验后发现,有一种能够有效消灭大肠内腐败细菌的杆菌,并将它命名为“保
加利亚乳酸杆菌”【】。

梅契尼科夫根据他的研究写了《长寿》一书,此书一经发
行便在当时的医学领域中引起了轰动,并使益生菌得到了人们的普遍关注。

尽管梅契尼科夫令益生菌受人关注,但益生菌在当时还没有被定义甚至仍未
被定名。

直到年,等才第一次提出将益生菌定义为“对喂养动物
肠道
菌群平衡有益的促进物质或微生物【】。

随着对益生菌保健功效的进一步研究,
于年将其定义为“有助于肠道菌群平衡的微生物及其相关物质”。

为
了强调活菌体对机体的重要作用,通过实验研究于年将益生菌的定
义修改为“能通过改善肠道微生物平衡而对宿主产生有益影响的微生物活体制
品”【】。

随着研究的不断深入,复合型益生菌制剂的功效明显,等于
年进一步扩展此定义为“由单一或多种微生物组成的活菌制剂,当应用于人和动
物后,能通过改善宿主原籍菌群的组成,促进人和动物的健康,,【】。

后来,人们
发现死菌体细胞成分或代谢产物也具有与活菌相同的生理功能,进而于
年对益生菌制剂的定义不再强调活菌,而将其定义为“摄取后可起到改善
粘膜表面菌群或调解酶的平衡,或提高机体特异性或非特异性免疫力的含有生理
活性菌或死细胞包含代谢产物与细胞组成的微生物制剂【】。

随
着对益生菌研
究的不断深入,欧洲食品与饲料菌种协会于年第一次对益生菌作出了官方定义“益生菌是活的微生物,摄入充足的数量后,对宿主产生经论证的
一种或多种特殊健康益处”。

尽管经过多年研究,关于益生菌的定义至今仍未得
、
到统一,但其基本内容是相同的【】:①对宿主有益;②无毒性作用和无致病作用;
③能在消化道存活;④能适应胃酸和胆盐;⑤能在消化道表面定植;⑥能够产生黑龙江大学硕士学位论文
有用的酶类和代谢物;⑦在加工和贮存过程中能保持活性;⑧具有良好的感官特
性。

..益生菌的益生功能
人们对含益生菌制品的认识主要是从其可改善食品风味开始的,而随着对益
生菌益生功能的不断研究,其特殊的生理活性和营养功能正逐渐被人们所重视。

通过大量的研究已经证明,益生菌具有促进营养物质吸收、减缓乳糖不耐症、改
善肠道功能、降低血清胆固醇水平、降低血脂浓度、抗高血压、
抗肿瘤及增强机
体免疫力等功能?。

..益生菌的种类
目前认为,益生菌主要是人类和动物肠道内正常生理性菌和非肠道菌,其中
包括:①一般厌氧即耐氧的乳杆菌;②严格厌氧的双歧杆菌;③若干兼性厌氧
球菌等。

年,美国食品药物管理局公布的安全益生菌菌种共有种, 其中包括:黑曲霉、米曲霉、凝固芽孢杆菌、粘连芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短
小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、厌氧性拟杆菌、发酵乳杆菌、纤维二糖乳杆菌、弯
曲乳杆菌、载耳布吕克氏乳杆菌、乳酸乳杆菌、胚牙乳杆菌、罗特氏乳杆菌、肠
系膜明串球菌、乳酸片球菌、毛状拟杆菌、瘤胃拟杆菌、猪拟杆菌、青春双歧杆
菌、动物双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、嗜酸乳酸杆菌、嗜热性双歧杆
菌、短乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、啤酒片球菌、戊糖片球菌、费氏
丙酸菌、谢曼氏丙酸杆菌、酿酒酵母、乳酸链球菌、二乙酰乳酸链球菌、粪链球
菌、中间链球菌、乳链球菌、嗜热链球菌等。

在我国,卫生部发布的《可用
于食品的菌种名单》已从年公布的种增加到了年公布的种,其
中包括双歧杆菌属中的青春双歧杆菌、动物双歧杆菌乳双歧杆菌、两歧双歧
杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌:乳杆菌属中的嗜酸乳杆菌、干
酪乳杆菌、卷曲乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、德氏乳杆菌乳亚种、发酵乳
杆菌、格氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗
伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌及链球菌属中的嗜热链球菌等。

第章绪论
.乳酸菌的概述
..乳酸菌与益生菌之间的关系及乳酸菌的定义
从国内外公布的益生菌菌种可以看出,当今使用的益生菌菌种多属于乳酸
菌,如市售微生态制剂中常含有的嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、
瑞士乳杆菌、唾液乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、粪肠球菌、双歧杆菌等【‘。

事实上,益生菌与乳酸菌是从不同角度对某些细菌定义的。

益生
菌包括部分乳酸
菌,而乳酸菌不全是益生菌。

乳酸菌是从发酵糖产生乳酸机理方面考虑的,有些
对人类生活有益,有些则是有害的。

乳酸菌是一类能在可利用的碳水化合物发酵过程中产生大量乳酸的细菌,作
为细菌的重要组成成员之一,其广泛分布于人体、动物、植物、土壤、空气和水
中,其属于真细菌纲下真细菌目中的乳酸细菌科。

乳酸菌细胞形态多样,典型的
乳酸菌一般不运动,无芽孢,革兰氏染色阳性,过氧化氢酶试验阴性,兼性厌氧
或微好氧,具有严格的发酵类型。

乳酸菌都能发酵葡萄糖产生.、或
型乳酸,其发酵代谢产物为乳酸或主要产物为乳酸除乳酸外也有乙酸、乙醇、
琥珀酸等的混合产物,不产生多于个碳原子的挥发性酸‘粕】。

..乳酸茵的种类
年凌代文等报道,乳酸菌主要包含个属【】。

近年来,随着该菌群新
菌种被不断发现,分类学位置发生了很大变化,不仅原有属间种的归宿有所变动
而且建立了不少的新属及新种,现已将被发现的各乳酸菌分为个属,包括
个种及亚种【。

尽管乳酸菌的种属数量随着研究的深入而不断增加,但其中的益
生菌菌种仍主要为乳酸杆菌属及双歧杆菌属中的部分菌种。

.乳酸菌的鉴定
从历史的角度来看,乳酸菌的鉴定主要经历了四个发展时期,分别是经典分
类时期、化学分类时期、数值分类时期及分子分类时期‘。

当前,乳酸菌的鉴定
方法主要应用传统表型鉴定方法及分子生物学鉴定方法两类方法。

..乳酸菌的传统表型鉴定方法
乳酸菌的传统表型鉴定方法主要是将形态观察法和生理生化鉴定法两种方
法联合应用的。

黑龙江大学硕士学位论文
形态观察法一般可以通过三种途径实现:①平板菌落特征的观察,菌落的形
态会随培养基的组成、培养时间及培养温度的不同而不同;②光学显微镜观察,
该方法常用革兰氏染色法对染色后的菌体细胞进行观察;③电镜观察,电子显微
镜观察菌体形态及表面结构主要是通过扫描电镜或菌体细胞磷钨酸负染色的投
射电镜进行观察的【,。

乳酸菌的生理生化鉴定方法主要是采用糖醇类发酵试验,此方法已被作为国
际上对乳酸菌鉴定的通用方法,其方法主要是依据不同种乳酸菌对各种糖、醇利
用情况的不同作为乳酸菌种水平上鉴定依据的。

长久以来,传统表型鉴定方法在细菌分类中起着极为重要的作用,但此方法
主要依靠操作人员的主观判断很难解决对某些生理生化特性极其相似的菌种进
行鉴定,存在极大的局限性【】。

另外,该方法虽然成本较低,但其方法所获菌株
信息较少、费时费力、易被污染且不适于大批量样品的快速鉴赳。

..乳酸菌的分子生物学鉴定方法
当前,乳酸菌的鉴定仍较多的沿用传统表型鉴定方法,但此类方法时常不能
对乳酸菌菌株作出明确的种水平鉴定【¨,而想要将乳酸菌菌株鉴定至种的水平,
至少需要种表型试验【】。

随着科技的进步,多种分子生物学方法因其具有较
高的准确性及稳定性等优点已成功介入到乳酸菌鉴定领域,其鉴定方法主要包括
】:
/序列同源性分析、 /间隔区序列分析、
寡核苷酸探针、变性梯度凝胶电泳分析、温度梯度凝胶电泳分析、瞬时温度梯度
凝胶电泳、扩增核糖体限制性片段长度多态性分析、限制性片段长度多态
性分析、随机扩增多态性分析及核糖体分型等。

在上述的方法中, /序列同源性分析鉴定方法因其所得鉴定结果准确、稳定,已成为被
广泛应用的分子生物学鉴定方法。

...
及其结构特点
核糖体基因在细菌进化过程中相对保守,被认为是衡量生命进
化历史最理想的标尺【,原核生物含有种类型:、及 ,
它们分别含有、和个核苷酸。

虽然容易分析,但是核苷
酸太少,缺乏用于分类研究的足够遗传信息;而含有的核苷酸几乎是
的两倍,分析十分困难。

通过大量的研究证明, 的全长约为第章绪论
含有高度保
,片段长度适中、信息量较大且易于分析。

另外,
守区域、在不同的菌株间含有变异的核酸片段、是所有原核生物蛋白质合成所必
需的一种核糖体,因此可以用其描述各细菌间的亲缘关系【斯】。

细菌结构如图.,其中可变区序列因不同细菌而异,恒定区序
列基本保守,因此可以利用恒定区序列设计引物将基因片段扩增出来,
利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。

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图..细菌结构
..
...
/序列同源性分析原理
/序列同源性分析鉴定方法的原理是先将分离纯化后的细菌
富集培养,提取总或,通过设计 /的通用或特异引物,
利用技术获取细菌中的 /基因片段,测序后将获取的
/基因序列信息与等数据库中的已知序列数据进行同
源性分析来鉴定样本中可能存在的细菌种类,一般认为如果基因序列间的同源性
值大于.%,则可认为它们属于同一菌种【。

/序列同源性分析在乳酸菌鉴定中的应用
年,等【】对干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌及玉
米乳杆菌及基因片段进行测定,通过聚类分析、表型分
析及免疫印迹法试验等,建议将干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌归为干酪乳杆菌种,
不再单独命名副干酪乳杆菌。

另外发现,标准菌株在聚类分析中并没
有和干酪乳杆菌分在一个组,而是和玉米乳杆菌分在了一个组,因此认为
不应为干酪乳杆菌的标准菌株,而是玉米乳杆菌。

年,乌日娜四等采用黑龙江大学硕士学位论文
传统表型鉴定方法结合序列同源性分析鉴定方法对分离自内蒙古锡林
郭勒盟牧区自制酸马奶中的株乳杆菌进行鉴定,得到了株具有我
国自主知
识产权的益生菌菌株。

年,等【】对分
离自肠道的株乳酸菌
的及可变区序列进行测定,准确的将
序
株乳酸菌鉴定到种的水平。

年,等【】利用双歧杆菌
列设计的特异性引物对人和动物粪便中的双歧杆菌进行检测发现,样品中含有青
春双歧杆菌和牙质双歧杆菌且此方法可在菌体浓度为 /以上时对样品中
的双歧杆菌进行检测及鉴定。

年,. 序列
等【】利用
同源性分析鉴定方法对我国传统发酵食品豆汁中所含有的及
等乳酸菌进行了准确的鉴定。

. .
技术在细菌检测及鉴定中的应用
..质谱用于微生物检测及鉴定的发展历史
近年来,由于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱. 技术能
对被测样品进行准确、快速及高通量鉴定等优点被相继发现,其能否成为被广泛
应用的微生物鉴定方法已成为研究者们关注的焦点。

追溯历史,
利用质谱对微生
物进行鉴定的研究早在上世纪年代就已经开始了。

年,等】利用质谱仪结合高温裂解技术第一次完成了细菌的鉴定,从此拉开了质谱鉴定细菌的
“序幕”。

随着热裂解质谱、激光解吸电离、共振吸收、快原子轰击质谱的发展,
使得质谱在细菌鉴定中的应用日益广泛,但这些方法只能提供有限的菌株信息且
样品的准备过程较为复杂,不能达到理想的鉴定效果【。

】。

直到年
和两个研究组分别提出基质辅助激光解吸技术后才使质谱应用于生
物大分子分析得到了发剧。

随着电喷雾电离和基质辅助激光解吸电离技术的不
断完善,将质谱应用于微生物检测及鉴定领域的研究才逐渐“走上了正轨”,图
.展示了国外截止于年,与. 技术相关且应用于医学微生
物领域所发表文章的增加趋势【】。

第章绪论
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图..与技术相关且应用于医学微生物领域所发表文章的增加应用范围
包括菌株的鉴定与分型、具备抗菌素特异抗性菌株的鉴定. .
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.
.. .
的工作原理
质谱仪的一般工作原理是将样品逐一通过进样系统、离子源、质量分析器、
检测器及数据处理系统最后得到检测结果。

对于. 来说,其电离方式、质量分析器及需要基质成分是其有别于其它质谱技术的重要部分,图.
为其仪器构造的原理图【】。

..黑龙江大学硕士学位论文
样品板
真空泵监测摄像机真空泵
图..线性原理图
. 缸/
鲫
.
...基质辅助激光解吸电离
.
的离子源电离方式为被称作“软电离方式”的基质辅助激
光解吸电离,其基本原理是将微量样品与小分子基质混合或分别点加于靶板上,
待溶剂挥发后,样品与基质形成共结晶,经脉冲激光作用后,基质吸收激光的能
量跃迁到激发态,导致样品的电离【删,图.为其电离原理的示意图【】。

另外,
脉冲紫外激光,激光,波长,脉冲常被用于当前的细菌检
测及鉴定。

图.基质辅助激光解吸离子化原理图 .
. /第章绪论
...质量分析器
. 的质量分析器是飞行时间分析器。

飞行时间分析器的主要
组成部分是一个离子漂移管,这种分析器的原理是经电离后产生的离子在加速电
压作用下得到动能,离子以速度进入漂移区,假定离子在漂移区飞行时间
为、漂移区长度为、离子的质量为、离子的电荷量为,各参数之间的关
●~
系见公式.【。

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寺击专詈争 \/
、
公式.飞行时间分析器各参数之间的关系
. ? .
由公式可知,在和等参数不变的情况下,离子由离子源到达接收器的飞
行时间与质荷匕/的平方根成工比。

另外,此类分析器还具有很多
优点如
①此类分析器既不需要磁场,也不需要电场,只需要直线漂移空间;②扫描速度
快;③不存在聚焦狭缝,因此灵敏度很高;④测量的质量范围仅决定于飞行时间,
可达到几十万等。

...基质
基质在. 技术中起着至关重要的作用,其作用主要包括三个
方面‘】:①从激光光源吸收能量以防止被测大分子物质分解;
②使被测物分子分
离成单分子状态以防止它们聚集;③在被测物离子化过程中充当质子化试剂。

作
为基质必须满足一些共性【】:①在合适的溶剂中具有良好的溶解性能;②对激光
具有良好的吸收性能,以使能量在基质中累积;③有合适的反应活性等。

目前,
常用的基质主要有】:.氰基羟基肉桂酸、芥子酸、,.二
羟基苯甲酸、,?二羟基苯乙酮、.羟基吡啶甲酸及一
羟基偶氮苯苯甲酸等较好的水溶性、较小的挥发性及具有一定化学惰性
的有机芳香弱酸,不同的分析物需要根据实际情况选择不同的基质。

通常,应用
技术对蛋白质或多肽分析时常采用、或等作为
基质,图.展示了这三种不同基质的化学结构式。

黑龙江大学硕士学位论文
图..不同基质的化学结构式
..氰基.羟基肉桂酸;.芥子酸;.,.二羟基苯甲酸;
.. 缸 .
. ;. ;. ;
...检测器
采用. 技术对样品进行分析时一般用阳离子检测方式,因为
阴离子检测效率相对较小,只有和其它酸性化合物采用阴离子检测才更有
效】。

.. .
技术用于细菌鉴定的研究进展
采用. 技术对细菌进行检测及鉴定时,主要是根据其能够对
细菌的多种生物标记物进行准确的分析,通过测定这些生物标记物的
分子量或结构等信息完成细菌鉴定的。

这些生物标记物主要包括蛋白质、核酸、
脂类等成分【鲫。

等【利用. 检测大肠杆菌的菌体蛋白,
成功的对野生型及抗氨苄西林大肠杆菌进行了区分。

等【将经扩增得到的博德特氏菌属不同菌株
特异性基因片段包括
进行检测,将所得检测结果与数据库中已知序列
和用.
对比分析对博德特氏菌的不同菌株实施了鉴定。

相对于蛋白质及核酸两类生物标
记物而言,. 技术用于细菌脂类分析的研究较少。

等【以
▲
细胞膜磷脂作为生物标记物,利用. 对肠杆菌科的个菌种进行
了鉴定。

目前,以蛋白质作为生物标记物对细菌进行鉴定的研究正逐年增加,其
■
原因主要是由于:①在细菌体内蛋白质的含量较高,约占细菌干重的%;②蛋
白质在细胞中大多具有高度的保守性,如核糖体蛋白、核酸连接蛋白等;③
细菌蛋白质易于提取和分离,不需要扩增;④细菌蛋白质具有多样性和丰富性的
特点,利用菌体的多个蛋白质质量信息,可将菌株更为有效地鉴定到属、种甚至第章绪论曼曼鼍曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼皇曼皇曼曼曼曼曼皇曼曼璺曼曼曼曼曼曼曼
菌株的水平。

. 技术鉴定细菌所用的蛋白质主要是来自细胞表面、细胞裂
解物或细菌浸液】。

多年以来,人们从能够获得更多蛋白质信息的角度考虑,
对菌体细胞前处理方法进行了很多研究,如..等【】对革兰氏阳性菌和
革兰氏阴性菌进行. 分析时发现,由于革兰氏阳性菌和革兰氏阴▲
性菌的细胞壁结构不同,当采用相同的处理方案时,革兰氏阳性菌所得质谱图中
离子峰的数量较少、强度较低且质量范围较窄。

因此,对于革兰氏阳性菌进行分
析时,必须先进行细胞壁的破坏才能得到信息量较多的谱图。

尽管这一实验结论
有一定的指导意义,但随着全细胞质谱鉴定方法的建立及发展,使
能够获得更为全面的菌体蛋白质信息且样品处理过程更为简单,这令其成为
技术鉴定细菌的首选方法。

目前. 等【利用机械破
碎、酶解、乙醇处理及热处理等四种方法对革兰氏阳性节杆菌属菌株细胞进行裂
解,随后对裂解物进行. 分析,将分析结果与未被处理的全细胞分析结果进行比较发现,全细胞分析相对于其他菌体处理方法能。