骨松灵合剂对去卵巢大鼠骨组织雌激素受体表达的影响

骨松灵合剂对去卵巢大鼠骨组织雌激素受体表达的影响
林良妍;王旭光;李杨
【摘要】目的探讨骨松灵合剂对去卵巢大鼠骨组织雌激素受体(ER)表达的影响.方法本实验采用免疫组织化学方法检测雌性大鼠去卵巢后骨组织中ER的变化,以及骨松灵合剂、雌激素治疗后对其产生的影响.结果椎体松质骨中ERα、ERβ主要分布于骨小梁周围的成骨细胞、破骨细胞及骨髓基质细胞中,阳性颗粒为棕黄色,胞浆胞核均有表达,但胞核着色较深,与假手术组(sham
组)(ERα:140.6±5.7;ERβ:118.6±6.5)比较,去卵巢对照组(OVX
组)(ERα:119.2±7.1;ERβ:80.8±3.7)大鼠骨小梁周围及骨髓中阳性细胞灰度明显降低(P＜0.01),而中药组(ERα:137.5±4.9;ERβ:113.8±7.4)、E2组
(ERα:143.8±6.2;ERβ:116.6±4.8)阳性细胞灰度与OVX组相比显著增加(P＜0.01),中药组与E2组相比较差异无明显统计学意义(P＞0.05).结论骨松灵合剂可以上调大鼠去卵巢后骨组织中ERα、ERβ表达,促进骨形成,可能是治疗骨质疏松症的重要机制.
【期刊名称】《济宁医学院学报》
【年(卷),期】2010(033)001
【总页数】3页(P15-17)
【关键词】骨松灵合剂;去卵巢大鼠;雌激素受体
【作者】林良妍;王旭光;李杨
【作者单位】山东省医学科学院,山东,济南,250062;济宁医学院附属第一人民医院,山东,济宁,272011;山东省医学科学院,山东,济南,250062
【正文语种】中文
【中图分类】R
骨质疏松症(Osteoporosis OP)是一种以骨量减少、骨组织显微结构退化为特征,以致骨的脆性增高而骨折危险性增加的一种全身性骨病,多发生于中老年人和绝经后妇女。

根据其发病原因,可分为原发型、继发型和特发型骨质疏松等不同类型,其中,以原发型骨质疏松尤其是绝经后骨质疏松症(I型)最为常见。

雌激素替代治疗绝经后骨质疏松症的作用机制至今没有定论。

目前报道有关机制包括骨平衡学说、骨转化学说、中间代谢产物学说、受体学说以及定点学说等[1]。

在正常生理状态下骨的吸收和形成维持平衡,而绝经后妇女骨转换率增加,骨吸收大于骨形成,发生骨量丢失而导致骨质疏松,这与雌激素水平下降相关。

雌激素通过骨细胞上ER介导骨代谢,同时雌激素水平降低导致ER数量和功能下降[2]。

根据祖国传统医学治疗骨质疏松的补肾填精、调节阴阳平衡的原则基础上,组方骨松岭合剂,并采用免疫组织化学方法检测雌性大鼠去卵巢后骨组织中ER的变化,以及骨松灵合剂、雌激素治疗后对其产生的影响。

本实验从受体的角度出发探讨去卵巢大鼠OP的发病机制及骨松灵合剂的调整作用。

1 材料和方法
1.1 实验材料
动物的选择:选用32周龄健康雌性(SD)大鼠,体重300～400g,由重庆医科大学实验动物中心提供。

药物及制备:(1)仙灵脾、补骨脂、骨碎补、淫羊藿、川断、桑寄生、熟地黄等组成,在医院制剂室水煎浓缩成1:1浓度,即每毫升药液中生药含量为1g。

(2)西药尼尔雌醇片,北京四环制药有限公司生产。

器械及试剂:常规手术器械若干套;各种规格微量移液器;离心机;恒温水浴箱;医学图像分析管理系统(北航CMIAS99系列);兔抗ERα(MC-20) sc-542和山羊抗ERβ(L-20)sc-6822(Santa Cruz产品);SPTM试剂盒;其余试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 实验性骨质疏松动物模型的建立与分组
共选45只SD大鼠,其中5只作为阴性对照组,将剩余40只随机分为4组:假手术组(sham组)10只,卵巢切除组(OVX组)10只,尼尔雌醇治疗组(E2组)10只,骨松灵合剂治疗组(中药组)10只。

大鼠经1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(40mg/ kg体重),上述四组大鼠均从背部切除双侧卵巢, sham组大鼠手术过程与卵巢切除组相同但不切除卵巢而切除小块脂肪组织。

6周后,眼球内侧取血,同时sham组和OVX组随机取两只大鼠的股骨和第一腰椎进行病理切片观察以确定OP模型的建立。

E2组给予尼尔雌醇灌胃,剂量为
0.21mg/kg体重,15天1次;中药组每日灌胃中药1次,剂量为12.6 mg/kg体重。

药物剂量均由成人等效剂量按体表面积折算,连续给药12周(在治疗初期,由于灌胃技术及气温骤变等原因导致E2组死亡1只、中药组死亡2只)。

治疗12周后,常规喂养1周,禁食并收集相应血尿标本检测,将全部大鼠股动脉放血处死(时间集中在上午8～10时进行)。

1.3 腰椎ERα和ERβ的免疫组化检测
分离大鼠第一腰椎,将腰椎上的肌肉剔除,固定于10%的多聚甲醛中,1周后放于8%的中性EDTA中,4℃脱钙,每周更换脱钙液1次,待腰椎脱钙完全如橡胶感后,常规石蜡包埋切片,切片脱蜡后用 1%甲醇-过氧化氢液处理 30min后, 0.01mol/L的PBS 冲洗,将切片放入盛有枸橼酸钠缓冲液的修复盒中,置微波炉内使容器内液体温度保持在92℃～98℃并维持12min。

冷却后经0.01mol/L的PBS充分冲洗,山羊血清处理30min后,采用SPTM试剂盒进行染色,加入兔抗ERα或山羊抗ERβ后置于4℃冰箱过夜,再加入生物素标记的
二抗(37℃),60m in后加入辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素,孵育30 min后,二甲氨基偶氮苯(DAB)-过氧化氢显色约5min,用0.01m ol/L的 PBS充分冲洗以终止反应。

以上各步骤之间均用0.01mol/L的PBS冲洗3次,每次5m in,阴性对照用0.01m ol/L的PBS替代第一抗体。

每组动物选5只,每张切片选5个视野,应用医学图像分析仪测定阳性细胞灰度值。

1.4 数据处理分析
实验结果以±s表示,进行单因素方差分析。

2 结果
免疫组化结果显示,椎体松质骨中ERα、ERβ主要分布于骨小梁周围的成骨细胞、破骨细胞及骨髓基质细胞中,阳性颗粒为棕黄色,胞浆胞核均有表达,但胞核着色较深,然而,卵巢被切除后导致骨质疏松的OVX组大鼠与sham组相比较,骨小梁周围及骨髓中ERα、ERβ分布较稀疏,中药组与E2组中受体的分布无明显差异。

从阳性细胞灰度的角度来看,OVX组大鼠较sham组明显降低(P＜0.01),而中药组、E2组与OVX组相比显著增加(P＜0.01),中药组与E2组比较差异无明显统计学意义(P＞0.05)。

(见表1)。

表1 免疫组化检测ERα、ERβ在大鼠骨组织中的表达注:与sham组比较,*P＜0.01;与OVX组比较,#P＜0.01组别 n ERα阳性表达 ERβ阳性表达sham组 5
140.6±5.7 118.6±6.5 OVX组5 119.2±7.1* 80.8±3.7* E2组5 143.8±6.2# 116.6±4.8#中药组5 137.5±4.9# 113.8±7.4#阴性对照组5 140.2±3.8
117.9±5.4
3 讨论
已有实验证实,成骨细胞、破骨细胞和骨髓基质细胞中均有ERα、ERβ表达,而且ERα和β与雌激素的亲和力相似,并可与共同ER反应元件结合,但是与各种不同的
选择性ER调节剂的亲和力却不相同[3],表明雌激素通过ERα、ERβ直接作用于骨组织中多种细胞而调节代谢。

骨稳态的维持依赖于骨形成和骨吸收之间的平衡,成骨细胞主要负责骨形成,破骨细胞主要负责骨吸收。

体外实验的研究证明,雌激素通过其受体对成骨细胞的增殖、分化、对机械应变的适应性应答[4]及其基质蛋白的合成有直接促进作用,而且成骨细胞上ER的表达依赖于细胞周期。

雌激素通过ER 直接诱导破骨细胞的凋亡、抑制破骨细胞的骨吸收活性[5]。

因此雌激素对成骨细胞和破骨细胞的直接作用可能是维持正常的骨重建的主要机制之一。

有研究显示IL-6是调节骨吸收的关键因子,雌激素可以通过ER作用于IL-6基因启动子近端225bp的序列,影响其转录活性,抑制IL-6基因的表达[6],通过抑制基质细胞、成骨细胞 IL-6的合成,发挥抑制骨吸收的作用[7],所以当去卵巢大鼠雌激素水平迅速降低后,其受体转录和翻译水平同时受到抑制从而导致骨量的快速丢失。

目前治疗骨质疏松的药物有几种:双磷酸盐类、钙类、雌激素类药物、降钙素类、SERM s等[8],这些药物治疗骨质疏松的疗效不等,可以不同程度的延缓骨质疏松的发生。

而中医理论认为,肾藏精、主骨、生髓,为先天之本,肾精充足,骨髓充盈,骨骼强劲坚固;肾精亏损,骨髓不足,骨质脆弱。

妇女绝经是天葵已绝的表现,表现为肾虚,在骨表现为OP。

因此治疗上宜补肾填精,通过调节肾阴肾阳平衡而使整个机体功能恢复。

本研究中的组方是根据中医理论结合现代药理研究拟订的方药。

该方药在动物实验和临床观察均取得了良好的疗效。

为进一步阐明其防治OP的机制,本实验观察了其对去卵巢大鼠骨组织ER的影响。

结果发现,骨松灵合剂可以提高去卵巢大鼠骨组织ER水平,从而增加骨形成,抑制骨吸收,从而起到治疗OP的作用。

OP的发生与多种因素有关,其发病机理的复杂性,决定了其治疗必须是综合性与多靶点,才能达到较为理想的效果。

研究结果表明骨松灵合剂可能是通过多靶点、多途径来实现其治疗作用的。

更重要的是,骨组织、肠道、肾脏中ER的发现为中药发挥多位点的作用提供实验依据,骨松灵合剂是否也能够直接作用于肠道和肾脏调控
与钙磷代谢相关基因的表达尚有待进一步研究。

随着研究的深入,利用ER两种受体亚型对外源性配体的不同的反应,为治疗OP或其它由雌激素缺乏导致的综合征的新药研制与开发提供实验依据,为疾病的治疗开辟新的途径。

参考文献:
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