质粒DNA的提取及电泳
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2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。0.4N NaOH，2%SDS 使用前等体积混合，临时配置。
3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml，加ddH2O至100ml。4℃保 存备用。
4. 酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）
四． 操作步骤
点样梳子底部离电泳胶模底部的距离为1.0mm。 3. 制备1%琼脂糖凝胶。 （0.2克琼脂糖，加20毫升0.5倍的TBE） 4. 将电泳胶模四周密封好，防止浇灌琼脂糖凝胶板时发生渗透。
待琼脂糖凝胶冷却至60℃左右时，加入一滴溴化乙锭，摇匀， 轻轻倒入电泳胶模中，琼脂糖凝胶的厚度在3～5mm。倒胶时要 避免产生气泡，若有气泡可用吸管小心吸去。 5. 琼脂糖凝胶凝固后，在室温放置20分钟，小心拔掉点样梳子和 电泳胶模两端的挡板，保持点样孔的完好。
6. 将电泳胶模放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，使电泳缓冲液面 高出琼脂糖凝胶表面1～2mm。如点样孔内有气泡，用吸管小心 吸出，以免影响加样。
7. 将DNA样品与1/5体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液混合。 8. 用微量移液器将样品小心加入加样孔内，记录样品点样秩序。 9. 盖上电泳槽，开启电源开关，最高电压不超过5V/cm（100～
1. 在50毫升的LB培养基中加入50微升氨苄青霉素（终浓度50微克/毫升）， 接入含PUC19的大肠杆菌，37度过夜培养。
2. 取1ml培养物入微量离心管中，室温离心12000转×30s，弃上清，将离心 管倒置，使液体尽可能流尽，将10毫升菌体收集在1个小指管中。
3. 将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。 4. 加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离
心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中 菌液逐渐变清）。 5. 加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀， 可在冰上放置15min。12000转，10分钟，将上清移到另一个小指管中。 （溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性， 形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。）
8. 1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀2次（每次离心12000转×5min）， 弃上清，将沉淀在室温下晾干。
9. 沉淀溶于20μl TE缓冲液（超纯水）， -20℃保存备用。
实验二、质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
一． 实验目的：学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的构 型
150V恒压电泳），使DNA从负极向正极移动。 10.电泳一般需1～2小时。电泳完毕后关闭电源，戴一次性塑料
手套取出凝胶，尽可能将所有的电泳缓冲液淋干，在紫外灯下 观察。
分子生物学实验
当你翻开书本的时候，你必须尽可能地展 开想象的“翅膀”，否则，你就不能走在 别人的前面;
而当你进入实验室时，要象脱下你的外衣 那样脱下你的想象力，因为实验操作中不 能有一丁点儿的想象，否则，你对事物的 观察就会受到影响。
实验相关知识
1、实验准备: 2、实验室安全与卫生 3、分组与实验操作 4、实验报告与成绩评定
二． 实验原理： 闭合环状质粒、线性质粒和开环质粒DNA由于构形不同，
在加溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳上呈现不同的迁移率， 因而在紫外灯下观察，能区别闭合环状质粒DNA、线性 质粒DNA和开环质粒DNA。
三． 实验方法
1. 选择合适的水平式电泳槽，调节电泳槽平面至水平。 2. 选择孔径大小合适的点样梳子，垂直架在电泳胶模的一端，使
5. 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，离心12000转× 10min，将上清移到另一个小指管中。
6. 加入等体积的氯仿/异戊醇，振荡混匀，离心12000转× 10min， 将上清移到另一个小指管中。
7. 加入2倍体积预冷的无水乙醇，旋涡混匀，-20 ℃放置30min， 离心12000转×10min，去上清。
通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来
三． 试剂准备
1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)， 10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl(pH 8.0） 12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖 4.730g，加ddH2O至500ml。高压灭菌15min ，贮 存于4℃。
SDS是一种阴离子表面活性剂，即可使细菌裂解，又可使蛋白 变性，因此用SDS处理细菌会导致细菌细胞壁的破裂，从而使 质粒DNA和基因组DNA同时从细胞中释放出来。
释放出的DNA在强碱的作用下发生变性，再用酸性醋酸钾（KAc） 缓冲液中和，质粒DNA迅速复性，而基因组DNA分子量太大不能 复性。
离心后，质粒DNA在上清中，而基因组DNA与细胞碎片一起沉淀 至离心管底部。
离心机的使用
移液器的使用
实验一、质粒DNA的提取纯化
一． 实验目的: • 学习与掌握最常用的质粒DNA的提取与纯化
方法 二． 实验原理: • 碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒
DNA的变性与复性一定结构的物质，一些特殊的环境会导致DNA变性， 如加热、极端PH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的 环境又可以使DNA复性
3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml，加ddH2O至100ml。4℃保 存备用。
4. 酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）
四． 操作步骤
点样梳子底部离电泳胶模底部的距离为1.0mm。 3. 制备1%琼脂糖凝胶。 （0.2克琼脂糖，加20毫升0.5倍的TBE） 4. 将电泳胶模四周密封好，防止浇灌琼脂糖凝胶板时发生渗透。
待琼脂糖凝胶冷却至60℃左右时，加入一滴溴化乙锭，摇匀， 轻轻倒入电泳胶模中，琼脂糖凝胶的厚度在3～5mm。倒胶时要 避免产生气泡，若有气泡可用吸管小心吸去。 5. 琼脂糖凝胶凝固后，在室温放置20分钟，小心拔掉点样梳子和 电泳胶模两端的挡板，保持点样孔的完好。
6. 将电泳胶模放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，使电泳缓冲液面 高出琼脂糖凝胶表面1～2mm。如点样孔内有气泡，用吸管小心 吸出，以免影响加样。
7. 将DNA样品与1/5体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液混合。 8. 用微量移液器将样品小心加入加样孔内，记录样品点样秩序。 9. 盖上电泳槽，开启电源开关，最高电压不超过5V/cm（100～
1. 在50毫升的LB培养基中加入50微升氨苄青霉素（终浓度50微克/毫升）， 接入含PUC19的大肠杆菌，37度过夜培养。
2. 取1ml培养物入微量离心管中，室温离心12000转×30s，弃上清，将离心 管倒置，使液体尽可能流尽，将10毫升菌体收集在1个小指管中。
3. 将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。 4. 加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离
心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中 菌液逐渐变清）。 5. 加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀， 可在冰上放置15min。12000转，10分钟，将上清移到另一个小指管中。 （溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性， 形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。）
8. 1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀2次（每次离心12000转×5min）， 弃上清，将沉淀在室温下晾干。
9. 沉淀溶于20μl TE缓冲液（超纯水）， -20℃保存备用。
实验二、质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
一． 实验目的：学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的构 型
150V恒压电泳），使DNA从负极向正极移动。 10.电泳一般需1～2小时。电泳完毕后关闭电源，戴一次性塑料
手套取出凝胶，尽可能将所有的电泳缓冲液淋干，在紫外灯下 观察。
分子生物学实验
当你翻开书本的时候，你必须尽可能地展 开想象的“翅膀”，否则，你就不能走在 别人的前面;
而当你进入实验室时，要象脱下你的外衣 那样脱下你的想象力，因为实验操作中不 能有一丁点儿的想象，否则，你对事物的 观察就会受到影响。
实验相关知识
1、实验准备: 2、实验室安全与卫生 3、分组与实验操作 4、实验报告与成绩评定
二． 实验原理： 闭合环状质粒、线性质粒和开环质粒DNA由于构形不同，
在加溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳上呈现不同的迁移率， 因而在紫外灯下观察，能区别闭合环状质粒DNA、线性 质粒DNA和开环质粒DNA。
三． 实验方法
1. 选择合适的水平式电泳槽，调节电泳槽平面至水平。 2. 选择孔径大小合适的点样梳子，垂直架在电泳胶模的一端，使
5. 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，离心12000转× 10min，将上清移到另一个小指管中。
6. 加入等体积的氯仿/异戊醇，振荡混匀，离心12000转× 10min， 将上清移到另一个小指管中。
7. 加入2倍体积预冷的无水乙醇，旋涡混匀，-20 ℃放置30min， 离心12000转×10min，去上清。
通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来
三． 试剂准备
1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)， 10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl(pH 8.0） 12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖 4.730g，加ddH2O至500ml。高压灭菌15min ，贮 存于4℃。
SDS是一种阴离子表面活性剂，即可使细菌裂解，又可使蛋白 变性，因此用SDS处理细菌会导致细菌细胞壁的破裂，从而使 质粒DNA和基因组DNA同时从细胞中释放出来。
释放出的DNA在强碱的作用下发生变性，再用酸性醋酸钾（KAc） 缓冲液中和，质粒DNA迅速复性，而基因组DNA分子量太大不能 复性。
离心后，质粒DNA在上清中，而基因组DNA与细胞碎片一起沉淀 至离心管底部。
离心机的使用
移液器的使用
实验一、质粒DNA的提取纯化
一． 实验目的: • 学习与掌握最常用的质粒DNA的提取与纯化
方法 二． 实验原理: • 碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒
DNA的变性与复性一定结构的物质，一些特殊的环境会导致DNA变性， 如加热、极端PH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的 环境又可以使DNA复性