二甲双胍对肾癌细胞凋亡的影响及机制_李明

增殖及其移植瘤的生长［6-9］。我们在前期的研究中已经 发现二甲双胍能够抑制肾癌细胞增殖，同时能够抑制肾 癌裸鼠移植瘤的生长［10］。但尚不清楚二甲双胍对肾癌 细胞的凋亡是否有影响。本研究将以体外培养的肾癌 786-O 细胞为研究模型，探讨二甲双胍对肾癌细胞凋亡 的影响，并从分子水平探讨引起上述影响的可能机制。 希望通过以上研究，明确二甲双胍对肾癌细胞凋亡的影 响，为二甲双胍的抗肿瘤效应提供新的证据，为转移性 肾癌的临床治疗提供新的思路和治疗选择。
收稿日期：2011-05-11 基金项目：国家自然科学基金（31000633） Supported by National Natural Science Foundation of China(31000633). 作者简介：李 明，博士，讲师，电话：020-61648207，E-mail: looselm@126. com 通 讯 作 者 ：白 晓 春 ，博 士 ，教 授 ，电 话 ：020-61648724，E-mail: baixc15@ /kcms/detail/44.1627.R.20110825.1140.001.html
转移性肾癌的治疗是临床上非常棘手的问题，手术 无法进行根治性切除，传统的放疗、化疗及免疫治疗对 其均不敏感［1］。索拉非尼与舒尼替尼等分子靶向治疗 药物的出现在一定程度改变了转移性肾癌的治疗局面， 有大约 10%~30%的患者因此而延长了无进展生存期和 提高了存活率［2］。但由于其治疗效果的非普遍性以及 高费用比，使得寻找肾癌治疗新的靶点及药物成为研究 热点。二甲双胍是临床上广泛使用的一种双胍类降糖 药物，最近的研究发现使用二甲双胍的糖尿病患者其患 癌风险降低［3-5］，并且体外实验发现二甲双胍能够抑制前 列腺癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、黑色素瘤细胞的
我们进一步探讨二甲双胍通过什么机制诱导 786-O 细胞在低浓度血清环境下凋亡。10%和 0.5%胎 牛血清环境下加入0~50 mmol/L二甲双胍处理24 h后， Western blot 检测促凋亡蛋白 Caspase-9 的表达。结果 表明，在正常浓度血清培养环境下，二甲双胍处理对 Caspase-9 的表达量无影响，而在低浓度血清环境，二甲 双胍处理使 786-O 细胞中 Caspase-9 表达量增加，并呈 浓度依赖效应（图 3），说明 Caspase-9 介导的细胞凋亡是 二甲双胍诱导 786-O 细胞在低浓度下血清环境下凋亡 的重要机制之一。 2.3 二甲双胍诱导 786-O 在低浓度血清环境下的凋亡 与其激活 AMPK 无关
of Urology, Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command, Guangzhou 510010, China
Abstract: Objective To evaluate the effect of metformin on the apoptosis of renal cell carcinoma (RCC) cells in vitro and its mechanisms. Methods Fluorescent microscopy and flow cytometry were used to examine the changes in the apoptosis of 786-O cells after metformin treatment. The possible signaling molecules involved in this process were analyzed by immunoblot analysis of AMP-activated protein kinase (AMPK) signaling and caspase 9. Results Metformin induced apoptosis and caspase 9 activation in 786-O cells in low-serum medium but not in normal-serum medium. Metformin also induced AMPK activation in 786-O cells, but this activation was not associated with the cell proliferation inhibition or apoptosis-inducing effect of metformin. Conclusion Metformin can induce apoptosis of RCC cells in vitro, suggesting its potential as a therapeutic agent for RCC. Key words: renal cell carcinoma; metformin; cell proliferation; apoptosis; AMP-activated protein kinase
第9期
李 明,等.二甲双胍对肾癌细胞凋亡的影响及机制
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Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) ；磷酸化 AMPK alpha 抗体购自Cell signa（l Cell Signaling Inc，Beverly, MA）； β-actin、AMPK 抗体，辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠， 山羊抗兔，兔抗山羊二抗和化学发光试剂盒均购自 Santa Cruz；Tris碱、甘氨酸、十二烷基磺酸钠，硝酸纤维 素膜购自 BIO-RAD；细胞培养板、培养皿、移液管购自 Corning；Annexin Ⅴ/PI 双染法细胞凋亡检测试剂盒购 自凯基公司；其他试剂和耗材均为国产。 1.2 方法 1.2.1 Annexin V-FITC/PI染色观察细胞死亡 将生长状 态良好的 786-O 细胞接种至六孔培养板，在含 10%胎牛 血清的培养基中培养 24 h 后，更换培养基，分别加入含 10%胎牛血清和 0.5%胎牛血清的培养基，同时加入不 同 浓 度 的 二 甲 双 胍 ，继 续 培 养 24 h，进 行 Annexin V-FITC/PI 染色，荧光显微镜下观察、拍照。结果判定： 同一视野细胞分别在光镜和荧光显微镜下进行观察、拍 照，活细胞没有染色、在荧光显微镜下无显示，而死亡细 胞可以被染色、在荧光显微镜下呈红染表现。 1.2.2 Annexin V-FITC/PI流式细胞仪检测细胞凋亡 将 生长状态良好的 786-O 细胞接种至六孔培养板，在含 10%胎牛血清的培养基中培养 24 h 后，更换培养基，分 别加入含 10%胎牛血清和 0.5%胎牛血清的培养基，同 时 加 入 二 甲 双 胍 ，继 续 培 养 24 h，收 集 细 胞 ，利 用 Annexin Ⅴ/PI 双染法细胞凋亡检测试剂盒染色，然后 进行流式细胞仪检测。 1.2.3 MTT法测定细胞增殖 将生长状态良好的786-O 细胞按2×103个/孔接种于96孔板，每孔200 μl，每组设6 个平行孔。培养24 h待细胞贴壁后，换成含不同浓度二 甲双胍的培养基（0, 1, 5, 10 mmol/L），继续培养24、48、 72 h后，分别进行MTT测定，用酶联免疫检测仪测吸光 度值 A（570 nm 处）。活力细胞比率[Viable cells(% control)]，按 如 下 公 式 进 行 计 算 ，[Viable cells(% control)] =(An/A0) ×100%，其中 An表示处理组吸光度 值，A0表示对照组吸光度值。 1.2.4 蛋白提取和免疫印迹检测 细胞处理结束后，收 集并裂解细胞，比色法测定蛋白浓度，定量上样进行 10%~12%的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离（电泳 1.5~ 2 h），将凝胶上的蛋白质于 4 ℃电转移到硝酸纤维素膜 上，封闭缓冲液（TBS：0.02 mol/L Tris-HCl，pH 7.5、0.5 mol/L NaCl，0.1% Tween-20，5%脱脂奶粉）室温下封闭 60 min，TBS 洗膜 3 次后加入抗体室温下孵育 1 h，TBS 洗膜后二抗孵育1 h，TBS再次洗膜后，加入化学发光试 剂显色1 min进行曝光显影。 1.2.5 统计学分析 每组实验重复3次，取平均值进行计 算处理，采取单因素方差分析进行统计学分析，LSD、 SNK 法进行组间差异比较，利用 SPSS13.0 软件进行上
Effect of metformin on apoptosis of renal cell carcinoma cells in vitro and its mechanisms
LI Ming1, LIU Jun2, HU Wei-lie2, JIA Chun-hong1, LI Hai-yan1, WEN Zhi-hua1, ZOU Zhi-peng1, BAI Xiao-chun1, LUO Shen-qiu1 1Department of Cell Biology, School of Basic Medical Sciences, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China; 2Department
我们利用annexinvfitcpi染色观察786o细胞死亡情况发现在含10胎牛血清培养基环境中二甲双胍处理组在荧光显微镜下没有观察到红染的死亡细胞而当将培养基更换成含05胎牛血清培养基时光镜下见二甲双胍处理组部分细胞出现变圆皱缩等改变荧光显微镜下观察见出现红染的死亡细胞图1
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·基础研究·
南方医科大学学报（J South Med Univ）
二甲双胍对肾癌细胞凋亡的影响及机制
2011;31(9)
李 明 1，刘 俊 2，胡卫列 2，贾春宏 1，李海燕 1，温芝华 1，邹志鹏 1，白晓春 1，罗深秋 1 1南方医科大学基础医学院细胞生物学教研室，广东 广州 510515；2广州军区广州总医院泌尿外科，广东 广州
510010
摘要：目的 探讨二甲双胍对肾癌细胞凋亡的影响及其机制。 方法 通过 Annexin V-FITC/PI 染色镜下观察及流式细胞仪 检测观察二甲双胍对 786-O 细胞凋亡的影响，通过免疫印迹检测 AMPK 信号及 Caspase 9 表达探讨可能分子机制。结果 二甲双胍能够诱导786-O在低浓度血清环境凋亡，激活Caspase 9，二甲双胍能够激活786-O细胞中AMPK信号，但与其凋 亡诱导效应无关。 结论 二甲双胍能够诱导肾癌细胞在低浓度血清环境凋亡，具有潜在治疗肾癌作用。 关键词：二甲双胍；肾细胞癌；细胞增殖；细胞凋亡；AMPK 中图分类号：R979.1 文献标志码：A 文章编号：1673-4254（2011）09-1504-05
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株 肾癌 786-O 细胞株购自中国科学院上海 细胞40 培养基中。 1.1.2 主要试剂 Rose Park Memorial Institute（RPMI） 1640、DPBS和胎牛血清购自Gibco BRL（Gaithersburg， MD，USA）；二甲双胍（metformin）、Compound C 购自
述统计学分析，图中数据为均数±标准差，P<0.05 被认 为具有统计学意义。
2 结果 2.1 二甲双胍诱导肾癌 786-O 细胞在低浓度血清环境 凋亡
我们在前期研究中发现二甲双胍能够抑制肾癌 786-O 细胞增殖，我们想知道二甲双胍对肾癌细胞凋亡 是否有影响。我们利用 Annexin V-FITC/PI 染色观察 786-O 细胞死亡情况，发现在含 10%胎牛血清培养基环 境中，二甲双胍处理组在荧光显微镜下没有观察到红染 的死亡细胞，而当将培养基更换成含 0.5%胎牛血清培 养基时，光镜下见二甲双胍处理组部分细胞出现变圆、 皱缩等改变，荧光显微镜下观察见出现红染的死亡细胞 （图 1）。我们进一步通过流式细胞仪对二甲双胍诱导的 细胞凋亡效应进行了定量分析，正常血清培养基环 境中，二甲双胍处理组 786-O 细胞与对照组凋亡细胞比 例无显著差异；当换成 0.5%的低浓度血清培养环境时， 10 mmol/L 二甲双胍处理组凋亡细胞比例为 23.5%，较 对照组 5.1%明显上升（P<0.05，图 2）。上述结果说明， 二甲双胍不能诱导 786-O 细胞在正常浓度血清环境下 凋亡，但是能够诱导 786-O 细胞在低浓度血清环境下凋 亡。 2.2 二甲双胍增加肾癌786-O细胞中Caspase-9表达