环孢素A及其衍生物FK506体内抗长爪沙鼠日本血吸虫病的研究

环孢素A及其衍生物FK506体内抗长爪沙鼠日本血吸虫病的
研究
柳建发;蒋雯雯;周飞;胡奇丰
【摘要】目的本文报告了曼氏血吸虫有明显杀虫效果的环孢素A及其衍生物
FK506对长爪沙鼠日本血吸虫病保护作用的初步研究.结果显示,环孢素A对长爪沙鼠日本血吸虫病有明显的保护作用,减虫率为41.62%;减卵率为72.91%;经环孢素A作用后,日本血吸虫虫体表面出现肿胀、水泡、破损、感觉乳突变形或消失等改变;而FK506则几乎没有作用,减虫率仅4.99%;减卵率仅6.39%;经FK506处理后,与对照组相比,虫体活力和皮层无明显变化.环孢素A与FK506两者间的杀虫区别值得进一步探讨.
【期刊名称】《中国人兽共患病学报》
【年(卷),期】2010(026)006
【总页数】3页(P572-574)
【关键词】环孢素A;FK506;长爪沙鼠;日本血吸虫病
【作者】柳建发;蒋雯雯;周飞;胡奇丰
【作者单位】宁波大学医学院,浙江,315211;宁波大学医学院,浙江,315211;宁波大学医学院,浙江,315211;宁波大学医学院,浙江,315211
【正文语种】中文
【中图分类】R383
日本血吸虫病是一种严重的人兽共患寄生虫病,其危害程度超过国外流行的曼氏血吸虫病和埃及血吸虫病。

我国主要分布于长江中下游及其以南的13个省、市、自治区,是我国危害最严重的寄生虫病。

对日本血吸虫常用的生物学研究技术主要有紫外线照射技术、电磁场技术、免疫学技术、分子生物学技术、电子克隆技术、激光共聚焦显微镜技术、高光谱遥感技术和生物信息学技术等〔1〕。

目前血吸虫感染的控制采用药物化疗和疫苗使用两种方式。

但疫苗临床使用尚未得以展开,而国内药物化疗主要是采用吡喹酮、蒿甲醚和青蒿琥酯,对控制日本血吸虫病的流行发挥了较好的作用。

曼氏血吸虫出现抗吡喹酮株,虽然日本血吸虫尚未出现抗吡喹酮株,但潜在的抗药性风险仍存在。

因此,寻找新的备选而有效的化疗药物,显得更加迫切。

本研究拟用对曼氏血吸虫病有效的环孢素A及其衍生物FK506体内治疗长爪沙鼠日本血吸虫病,试图观察该类药物在体内的抗血吸虫效果,为血吸虫病化疗方向提供实验依据。

1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 30只6-8w龄雌性长爪沙鼠;40±1g,购自浙江省医学科学院,由本单位实验动物中心繁殖、饲养。

将小鼠随机分为3组,1组为环孢素A治疗组;1组为环孢素A衍生物FK506治疗组;另1组为正常对照组,每组10只小鼠。

1.2 日本血吸虫尾蚴阳性钉螺购自浙江省医学科学院寄生虫病研究所钉螺室,以常规方法逸出并获得尾蚴。

1.3 感染方法将尾蚴收集于盖玻片上,腹部接种120±2条/鼠。

1.4 CsA和FK506的制备 CsA和FK506粉剂由英国格拉斯哥大学J R Kusel教授馈赠。

将CsA和FK506溶于纯酒精,制成100μ g/mL了的浓度,每鼠感染3w后背部注射CsA和FK506 5mg/kg/鼠。

1.5 观察指标于药物作用后5w断颈剖杀长爪沙鼠,观察减虫率(%)减卵率(%)。

1.5.1 减虫率(%)计算采用枸橼酸钠生理盐水从小鼠胸主动脉冲洗肺循环和体循环的方法获得虫体,减虫率计算方法如下：
1.5.2 减卵率(%)计算取3组小鼠剖杀,取出肝脏并分离置于组织匀将器内,加生理盐水,搅碎后经120目分样筛过滤,反复自然沉淀,倾去上清,定量吸取充分混匀的虫卵悬液,光镜下虫卵记数,计算每g肝组织内虫卵数(LEPG),并按下列公式计算减卵率。

1.6 统计分析用统计软件SPSS 12对上述观察指标进行数据统计分析,P＜0.01,差异有显著性。

2 结果
2.1 虫体减少率 CsA作用后,长爪沙鼠治疗组与正常感染对照组相比,减虫率为41.62%,有显著性差异(P＜0.01)。

肝组织内虫卵减少率CsA作用后,长爪沙鼠治疗组与正常感染对照组相比,肝虫卵数(LEPG)的减少率为71.29%,有显著性差异(P＜0.01)。

在FK506治疗组,长爪沙鼠减虫率和减卵率与正常感染对照组相比,无显著性差异(P ＞0.05)。

在CsA治疗组,与FK506治疗组相比,则有显著性差别(P＜0.01),见表1。

表1 CsA和FK506体内治疗长爪沙鼠日本血吸虫病的效果Table 1 Effects of Cyclosporine A and FK506 treatment on murine schistosomiasis in vivo组别Group鼠数No.of Mice检虫数Number of 减虫率Reduction Rate检卵数Eggs/Liver减卵率(%)P值P Value对照组10 25.42±8.2 - 11.26±3.1 - -CsA组10 14.84±6.9 41.62 3.05±2.4 72.91 ＜0.01 FK506组 10
24.15±10.7 4.99 10.54±5.4 6.39 ＞0.05
2.2 解剖显微镜下观察检获虫体情况 FK506作用组与对照组相比,除出现1条死亡
成虫之外,其余虫体均保持良好活性,虫体内结构清晰、皮层无明显损害、虫体伸缩
自如,感觉乳突明显。

而CsA治疗组,出现8条成虫死亡。

其他虫体可见皮层肿胀、破溃、感觉乳突消失、整个虫体萎缩,雌雄虫肠道蠕动缓慢、有膨胀、其内充满黑
色颗粒。

2.3 扫描电镜下日本血吸虫成虫超微结构：FK506作用组和对照组显示,虫体表面
可见横行而规则的皱褶,感觉乳突明显。

CsA治疗组,成虫体表结构明显改变,出现大小不一水泡样结构,严重者出现弥漫性肿胀,并出现破损,皱褶呈破絮状,口、腹吸盘肿胀外翻,外周感觉乳突消失。

3 讨论
本研究成功地建立了长爪沙鼠感染日本血吸虫的动物模型,虫体发育成熟,雌雄合抱,并产卵,肝脏可见虫卵性结节;并对沙鼠日本血吸虫病的CsA治疗组和FK506治疗
组获得的减虫率和减卵率进行了比较,结果显示CsA治疗组相比对照组有较高的减虫率和减卵率,提示CsA对长爪沙鼠日本血吸虫感染和日本血吸虫病有较好的疗效,且可以抑制雌虫产卵;而同为CsA衍生物的FK506治疗组,则几乎没有杀虫活
性,FK506治疗组与CsA治疗组相比,减虫率仅为4.99%;减卵率仅为6.39%。

经环
孢素A作用后,日本血吸虫虫体表面出现肿胀、水泡、破损、感觉乳突变形或消失
等改变;而FK506则几乎没有作用;经FK506处理后,与对照组相比,虫体活力和皮层无明显变化,显示CsA与其衍生物FK506对日本血吸虫的杀虫方面有明显的区别。

蔡茹等报道〔2〕,体外观察钙通道阻滞剂与肌动蛋白解聚/稳定剂与吡喹酮伍用杀
日本血吸虫的作用,发现与肌动蛋白解聚剂细胞松弛素D预孵育1h的虫体,能够完
全拮抗吡喹酮的杀虫效应;结论吡喹酮作用血吸虫的药物靶点可能与血吸虫的钙通
道有关。

CsA是含有11个甲基的环状氨基酸,分子量为 1 303Da〔3〕 ,由于其抗寄生虫的活性〔4-6〕 ,可作为治疗动物曼氏血吸虫病的首选药物〔7〕。

其作用机制
是,CsA和血吸虫体表和体内环孢素亲和蛋白相结合,进而导致雌虫产卵障碍和雄虫死亡〔8〕。

由于CsA有免疫抑制性的特点,过去常用于器官移植和自身免疫性疾病的治疗,但CsA的结构优化工作一直在进行〔9〕。

CsA的杀虫机制与吡喹酮的作用效应是否有共同性、CsA是否能代替吡喹酮应用于治疗日本血吸虫病是我们今后研究的课题。

周霞等〔10〕应用紫外线致弱日本血吸虫尾蚴成功诱导了BALB/c小鼠日本血吸虫病的免疫保护作用,免疫组的减虫率和减卵率分别为37.90%和51.16%;免疫组小鼠体内虫体发育明显滞后于对照组虫体;免疫组小鼠肝脏虫卵肉芽肿较正常组明显减少,提示我们在观察CsA和FK506对长爪沙鼠日本血吸虫病的保护力过程中,应观察经药物作用后长爪沙鼠的肝脏组织学变化以及嗜酸性粒细胞的分布。

FK506是CsA的衍生物,本研究显示其对小鼠日本血吸虫病没有治疗作用,可能是其活性杀虫基团被抑制所致〔11〕。

关于CsA和FK506的抗日本血吸虫的差异,应结合两者间的化学结构式和活性基团的异同,开展进一步的探索。

参考文献：
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〔2〕蔡茹,李欣,张惠琴,等.钙通道阻滞剂与肌动蛋白解聚/稳定剂对吡喹酮体外杀日本血吸虫作用的效应影响〔J〕.中国人兽共患病学报,2009,25(12)：1186-1191. 〔3〕Brindley PJ,Kalinna BH,Dalton JP,et al.Proteolytic degradation of host hemoglobin by schistosomes〔J〕.Mol Biochem Parasitol,1997,89,1-9. 〔4〕Wasilewski MM,Lim KC,Philips J,et al.Cysteine proteinase inhibitors block schistosome hemoglobin degradation in vitro and decrease worm burden and egg production in vivo〔J〕.M ol Biochem
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