高纯度花生过敏原蛋白Arah1的规模化放大制备

高纯度花生过敏原蛋白Ara h 1 的规模化放大制备
花生过敏是由花生中的某些蛋白引起的超敏反应, 严重威胁着过敏患者的身体健康。

其中Arah 1是花生中一种7S贮藏蛋白，占花生总蛋白的12-16%,约有90%以上的花生过敏患者对其过敏。

因此, 制备出高纯度的过敏原蛋白Ara h1 对于花生过敏研究至关重要。

本论文工作包括(1)Arah 1 实验室纯化方案的研究;(2)Arah 1 的小试规模放大纯化;(3) 花生过敏原蛋白Arah1 纯化的中试工艺设计。

研究的主要内容、结果和结论如下。

1 .采用硫酸铵分级沉淀法(0%、80%、100%) 处理花生蛋白浸提液, 并设计了三种层析纯化方案进行预实验, 最终确定先阴离子交换层析(柱床规格1.6cm x 36cm,流速1.5ml/min,0-300mmol/LNaCI 浓度梯度洗脱,500ml),再羟基磷灰石层析(柱床规格1.6cm x 6cm,流速0.8ml/min,20-100-150-200mmol/L 磷酸盐缓冲液阶梯式梯度洗脱)的两步纯化策略。

对该层析纯化方案进行的重复实验表明, 该方法具有很好的稳定性, 一次纯化周期Arah 1的产量在120mg以上，最终得到的Arah 1经SDS-PAG电泳检测，纯度为90%以上。

对纯化蛋白进行蛋白质肽指纹质谱分析表明, 电泳中190kD、
64kD 33kD的条带分别为Arah 1三聚体、Arah 1单体、Arah 1片段。

该纯化方法通量大、稳定性好、设备简单、纯化产品纯度高, 适合于小试规模放大实验。

2.完成了基于层析纯化方案的 1 0倍放大小试实验, 即阴离子交换层析柱床规格3.5cm x 36cm,流速7.2ml/min,洗脱缓冲液浓度范围不变，体积为2,400ml;羟基磷灰层析柱床规格2.6cm x 18cm,流速1.5ml/min,洗脱缓冲液浓度
范围不变
多次重复实验表明该纯化方案重现性好, 一次纯化周期中Arah 1的产量达到 1 克以上。

将实验室预实验纯化得到的Ara h 1 与小试纯化得到的Ara h 1 进行圆二色
光谱分析和ANS荧光探针表面疏水性分析，结果表明它们的二级结构和蛋白表面疏水性无明显差异。

另外, 产品的得率和纯度得到了很好的保持, 为后面的中试设计提供了可靠的实验参数。

3.设计完成了适合于Arah 1中试生产的工艺流程,规模为小试纯化规模的10倍,即一个纯化周期得到l0g 以上纯度在90%以上的Ara h 1 。

通过设计完成了设备选型, 并绘制了Ara h 1 中试纯化工艺的设备流程图, 为Ara h 1 的工业化制备奠定了基础。