靶向吲哚菁绿纳米探针介导的光声治疗

靶向吲哚菁绿纳米探针介导的光声治疗
钟俊平;杨思华
【摘要】Photoacoustic therapy is an approach using the photoacoustic effect of nanoparticle for targeting and selective destruction of cancer cells. Here, a novel functioned nanoprobe based on folic acid labeled indocyanine green-containing nanoparticle was developed to target and kill cancer cells under photoacoustic therapy. The results revealed that the nanoprobe had a high efficiency in cancer cell targeting and killing in folic acid positive EMT6 cells. The ICG-PL-PEG NPs based photoacoustic therapy would be a safe and highly efficient cancer treatment technique.%光声治疗是一种利用纳米材料的光声效应选择性破坏癌细胞的方法.本研究采用叶酸作为肿瘤靶向分子,以聚乙二醇包裹吲哚菁绿形成纳米粒子(ICG-PL-PEG-FA),利用此纳米粒子在近红外区的光吸收特性,开展光声治疗研究.实验结果表明,这种叶酸标记的纳米探针对高表达叶酸的EMT6细胞具有高靶向选择性和靶向光杀伤性.这种基于包含吲哚菁绿纳米探针的光声治疗将有潜力发展为一种安全,高效的癌症治疗技术.【期刊名称】《激光生物学报》
【年(卷),期】2012(021)005
【总页数】5页(P470-474)
【关键词】肿瘤靶向治疗;吲哚菁绿;光声治疗;纳米粒子;聚乙二醇;叶酸
【作者】钟俊平;杨思华
【作者单位】华南师范大学激光生命科学研究所暨激光生命科学教育部重点实验室,广东,广州,510631;华南师范大学激光生命科学研究所暨激光生命科学教育部重点
实验室,广东,广州,510631
【正文语种】中文
【中图分类】R318.51
肿瘤是严重威胁人类健康的一类疾病，死亡率高。

近年来，虽然肿瘤治疗已取得一些进展，但由于肿瘤发病因素的多样性和肿瘤细胞的复杂性，肿瘤治疗仍是全球面临的一项难题。

基于纳米技术的光声，光热，光动力疗法，被认为是更有效和更安全的［1-5］。

光声治疗肿瘤是一种利用光声效应杀死肿瘤细胞以达到治疗目的的治疗方法。

利用靶向的ICG-PL-PEG-FA纳米粒子选择性的进入肿瘤细胞，ICG-
PL-PEG-FA纳米粒子在脉冲激光的照射下产生超声波，这种内源性的超声能将肿
瘤细胞杀死。

这种细胞杀伤方法是一种机械的杀伤，无毒且不会使细胞产生耐药性。

光声治疗技术有几个潜在的优势:(1)机械原因造成的细胞损伤，因此不会造成毒性
和抗药性。

(2)这种方法用于癌症治疗的激光功率减少了150-1 500倍，而且能提高治疗效率［6］。

(3)光声效应不仅可以用于癌症治疗，也能应用于高分辨率的光声成像［7-8］。

人体组织在近红外(NIR)700至1 100 nm区域具有最低的吸收系数，光穿透生物
组织最深［9-10］。

作为美国联邦药物管理局批准的唯一人体可用的在近红外范
围［11-12］吸光能力强的染料，吲哚菁绿是发展临床可用的光声探针的最佳选择。

研究表明，吲哚菁绿在近红外的吸光能力特别强，对于780 nm的光，相同质量
的吲哚菁绿吸收光的能力是单壁碳纳米管的7倍多，是纳米金棒的8 500倍以上［13］。

我们开发了一个由吲哚菁绿和磷脂化聚乙二醇组成可用于光声治疗的纳米探针
(ICG-PL-PEGFA)［14］。

这种纳米粒子克服了吲哚菁绿的许多缺点，如在水溶液中稳定性较差，浓度依赖性聚集和缺乏肿瘤细胞靶向特异性等［15，16］。

这种纳米粒子有很多优点:(1)生物相容性好和对生物体相对无毒。

(2)可以提高ICG的稳定性，并延长其血浆半衰期。

(3)纳米粒子的大小约为18 nm，可以外渗到肿瘤组织中，并可以避免被网状内皮系统清除［17-18］。

(4)粒子表面为亲水性PEG，增强了纳米粒子的空间稳定性，使纳米粒子避免被单核吞噬细胞系统吸收，提高了它们在生物体中的流通时间。

本研究以叶酸为靶向分子，构建了叶酸标记的由吲哚菁绿和聚乙二醇组成的肿瘤靶向探针，研究了探针对肿瘤细胞的靶向性，同时利用此纳米粒子在近红外区域的光吸收特性，将此探针应用于近红外光声治疗，为肿瘤靶向治疗提供新思路。

磷脂化聚乙二醇，注射用吲哚菁绿，叶酸，细胞计数试剂盒8(CCK8)，JEM-
100CXII透射电子显微镜，激光共聚焦显微镜，紫外/可见分光光度计，可调谐激光器，放大器，示波器。

1.2.1 纳米材料的合成 ICG-PL-PEG和连接叶酸的ICG-PL-PEG-FA的合成方法如Zheng［14］所述。

1.2.2 ICG-PL-PEG纳米粒子的光声信号测量ICG-PL-PEG 纳米粒子的光声装置如图1。

我们分别检测了不同浓度ICG-PL-PEG溶液(ICG的浓度为10，20，40 和80 μg/mL)的光声信号。

光源为可调谐脉冲激光器，波长为808 nm，脉宽为10 ns，重复频率为10 Hz。

1.2.3 细胞培养小鼠乳腺癌细胞系(EMT6)培养液为RPMI 1640(GIBCO)。

均添加15℅胎牛血清(FBS)，100 units/mL青霉素和100 μg/mL 链霉素。

细胞用胰蛋白酶消化，转至细胞培养皿，在含5%的二氧化碳的37℃培养箱中培养。

高表达叶酸受体的FR+EMT6细胞通过将EMT6细胞在缺少叶酸的培养基中至少培养四代获得，通过这种方法确保获得的FR+细胞表面具有丰富的叶酸受体。

FREMT6细胞通过将EMT6细胞在具有丰富的叶酸的培养基中培养使其表面基本上没有可用
的叶酸受体。

1.2.4 透射电子显微镜实验我们使用 JEM-100CXII透射电子显微镜(TEM)电压为100 kV，电流是70 pA来检查ICG-PL-PEG纳米粒子的形态和大小。

测量的样品含ICG的浓度为5 mg/L(ICG∶PLPEG=1∶100)。

用铜网装载纳米探针后，风干观察。

1.2.5 光谱检测使用紫外/可见分光光度计(UV/ISspectrometer(Lambda 35，Perkin-Elmer，USA)测量ICG-PL-PEG溶液在500-1 000 nm处的吸光度，测量峰宽是5 nm，测量速度是200 nm/min。

1.2.6 激光共聚焦显微镜成像不同处理组的细胞的荧光成像均在Zelss公司LSM 510/ConfoCor 2型激光共聚焦扫描显微镜上完成，采用Plan-Neofluar 40×/1.3 NA油镜对细胞进行共聚焦成像，激发光源为氦氖激光器，激发波长为633 nm，发出的光通过LP 650纳米过滤记录。

记录的图像和数据均用Zeiss Rel 3.2软件系统进行分析。

载物台上配置了一个微型培养(Tempeontrol 37-2 digital，Zeiss)，保证整个成像实验过程中，细胞培养条件是37℃，5%C02，使细胞处于正常的生长条件，从而使实验结果更能反映正常生理条件下的情况。

1.2.7 细胞层面光声治疗细胞与ICG-PL-PEGFA纳米粒子共孵育3 h，用PBS清洗两遍后，用适量强度808 nm激光(脉宽10 ns，重复频率10 Hz)照射20 s。

1.2.8 细胞光声杀伤统计分析我们使用Cell Counting Kit-8(CCK8)的方法来测定不同处理组下的细胞存活率。

不同处理组的细胞以5×103个细胞/孔的密度在96孔板培养24 h，经过不同的处理后用CCK-8检测细胞活性。

通过使用酶标仪(INFINITEM 200，Tecan，Switzerland)检测450 nm处的吸光度来检测细胞的存活率及增殖情况。

图2A为ICG-PL-PEG纳米粒子溶液在可见及近红外区的吸收光谱，表明ICG-PL-PEG纳米粒子在800 nm处存在特征吸收峰.透射电子显微镜(TEM)拍摄的ICG-
PL-PEG纳米粒子的图像(图2B)表明，纳米粒子呈球形且具有良好的分散性，其直径约为18 nm。

为了证明ICG-PL-PEG纳米粒子的光声增强效应，我们测量了不同浓度下ICG-
PL-PEG纳米粒子的光声信号。

如图3所示，随着浓度的增加，ICG-PLPEG纳米
粒子的光声信号不断增强。

为了验证ICG-PL-PEG-FA纳米粒子的肿瘤靶向性，将探针分别与叶酸高表达的
FR+细胞和低表达的FR-细胞共孵育3 h，然后用共焦显微镜观察，从图4可见，在FR+细胞中可以观察到ICG的荧光，而在FR-细胞中几乎观察不到荧光。

其原
因为FR+细胞表面有高表达的叶酸受体，而FR-细胞上叶酸受体的表达匮乏，
ICG-PL-PEG-FA纳米粒子通过配体-受体介导的内吞途径能够准确的识别和进入FR+细胞，呈现高效靶向选择性。

为了直接观察叶酸修饰的ICG-PL-PEG-FA纳米粒子是否对细胞具有选择性杀伤作用。

我们把高表达叶酸受体和低表达叶酸受体的细胞，经过叶酸修饰的ICG-PL-PEG-FA纳米粒子(ICG的浓度为10 μg/mL孵育3 h)孵育和激光处理(20 mJ/cm2，20 s)后，在显微镜下观察细胞的形态。

从图5可以看出，孵育ICG-PL-PEG-FA
纳米粒子的FR+细胞光照后即出现剧烈的形态学变化。

而孵育ICG-PL-PEG-FA纳米粒子的FR-细胞与对照组形态相似，无明显形态学改变。

从而得出:ICG-PL-PEG-FA纳米粒子能够靶向进入高表达叶酸的FR+细胞，在激光照射下杀伤FR+
细胞;而不能够进入低表达叶酸的FR-细胞，因此在激光下，不能杀伤 FR-细胞。

结果表明 ICG-PLPEG-FA纳米粒子在肿瘤的靶向治疗中有广阔的应用前景。

我们研究了FR+EMT6细胞和FR-EMT6细胞与不同浓度的纳米粒子(ICG的浓度
为0，1，5，10，15和20 μg/mL)孵育3 h后经过相同能量密度(20 mJ/cm2，20 s)的激光处理的细胞杀伤效果。

结果表明FR+EMT6细胞活性随着浓度的增加
而迅速的降低(图6A)。

由于纳米粒子不能够进入低表达叶酸的FR-细胞，其活性
没有明显的改变。

同时我们研究了靶细胞(FR+EMT6细胞)在脉冲激光强度梯度下的光声杀伤效果，单脉冲能量密度从5 mJ/cm2到25 mJ/cm2。

图6B表明，在
这一系列激光强度下，没有孵育过纳米粒子的FR+EMT6细胞的活性没有明显的
改变。

加入靶向的纳米粒子(ICG的浓度为10 μg/mL孵育3 h)以后，随着激光强
度的增加，细胞活性迅速的降低。

我们成功合成了生物修饰的ICG-PL-PEG纳米粒子，这种探针在近红外区域对激
光能量具有强烈吸收。

本研究充分利用吲哚菁绿的近红外光吸收特性，以叶酸作为肿瘤靶向分子，成功制备了ICG-PLPEG纳米多功能探针。

这一探针通过叶酸配体-受体的特异性识别，对叶酸高表达的肿瘤细胞FR+细胞有高选择性，而对叶酸低表达的FR-细胞无选择性;而且在激光照射下，能够特异性杀伤高表达叶酸的FR+
细胞。

这种通过肿瘤细胞表面叶酸受体介导，将探针携带进细胞内，从而达到靶向杀伤肿瘤细胞，降低正常组织损伤的目的，为靶向肿瘤杀伤提供新方法。

可以预见，基于ICG-PL-PEG纳米粒子的光声治疗将在肿瘤的临床治疗中发挥重要作用。

*通讯作者:杨思华，男，副研究员，研究方向:生物光子学在生命科学中的应用研究。

(电话*************-8307;(电子邮箱)***************.cn
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