青霉素的生产工艺

青霉素生产工艺
刘世双
(山东农业大学生命科学学院，生物工程三班)
摘要：青霉素发酵属单一纯菌种发酵，青霉素生产菌制备是青霉素发酵过程的关键环节，生产菌种的质量是影响发酵生产水平的重要因素。

在生产过程中既要有优良的菌种，又要有良好的培养条件才能获得高质量的种子。

本文对有关青霉素的发酵工艺进行了介绍。

关键词;青霉素 ;发酵; 生产工艺
青霉素类和头孢菌素类等β-内酰胺抗生素系通过干扰细菌细胞壁的合成而产生抗菌作用，所以青霉素是一种高效、低毒、临床应用广泛的重要抗生素。

它的研制成功大大增强了人类抵抗细菌性感染的能力，带动了抗生素家族的诞生。

它的出现开创了用抗生素治疗疾病的新纪元。

通过数十年的完善，青霉素针剂和口服青霉素已能分别治疗肺炎、肺结核、脑膜炎、心内膜炎、白喉、炭疽等病。

抗生素的工业生产包括发酵和提取两部分。

工艺流程大致如下：菌种的保藏、孢子制备、种子制备、发酵、提取和精制。

1 青霉素发酵概述
青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。

青霉素类抗生素是β-内酰胺类中一大类抗生素的总称。

但它不能耐受耐药菌株(如耐药金葡)所产生的酶，易被其破坏，且其抗菌谱较窄，主要对革兰氏阳性菌有效。

青霉素是抗生素工业的首要产品。

中国为青霉素（penicillin）生产大国，国内生产的青霉素，已占世界产量的近70%，国内较大规模的生产企业有华药、哈医药、石药、鲁抗，单个发酵罐规模均在100 m3以上，发酵单位在70000 U/ml左右，而世界青霉素工业发酵水平达100000 U/ml以上。

2 青霉素生产原理
青霉素的工业生产包括发酵和提取两部分。

工艺流程大致如下：菌种的保藏、孢子制备、种子制备、发酵、提取和精制。

种子和发酵培养基的常用碳源有：葡萄糖、淀粉、蔗糖、油脂、有机酸等，主要为菌体生长代谢提供能源，为合成菌体细胞和目的产物提供碳元素。

有机氮源多用玉米浆、黄豆饼粉、麸质粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉等，硫酸铵、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸铵则是常用的无机氮源。

另外，培养基中还得添加无机盐、微量元素以及消沫剂，部分抗生素还得加入特殊前体，如青霉素的前体是苯乙酸，大环内酯类抗生素的前体是丙酸盐。

发酵过程普遍补加一种碳源、氮源物质，如葡萄糖和硫酸铵。

pH值通过流加氨水进行调节，很多抗生素在发酵中后期流加前体，对提高产量非常有益。

抗生素发酵绝大多数为好氧培养，必须连续通入大量无菌空气，全过程大功率搅拌。

发酵液的预处理，一般加絮凝剂沉淀蛋白，过滤去除菌丝体，发酵滤液的提取常用溶媒萃取法、离子交换树脂法、沉淀法、吸附法等提纯浓缩，然后结晶干燥得纯品
3 青霉素的发酵工艺过程
1 菌种的保藏
从来源于自然界土壤等，获得能产生抗生素的微生物，经过分离、选育和纯化后即称为菌种。

菌种可用冷冻干燥法制备后，以超低温即在液氮冰箱内保存。

所谓冷冻干燥是用脱脂牛奶或葡萄糖液等和孢子混在一起，经真空冷冻、升华干燥后，在真空下保存。

如条件不足时，则沿用砂土管在冰箱内保存的老方法，但如需长期保存时不宜用此法。

一般生产用菌株经多次移植往往会发生变异而退化，故必须经常进行菌种选育和纯化以提高其生产能力。

2 孢子的制备
生产用的菌株须经纯化和生产能力的检验，若符合规定，才能用来制备种子。

制备孢子时，将保藏的处于休眠状态的孢子，通过严格的无菌手续，将其接种到经灭菌过的固体斜面培养基上，在一定温度下培养 5 ～ 7日或7日以上，这样培养出来的孢子数量还是有限的。

为获得更多数量的孢子以供生产需要，必要时可进一步用扁瓶在固体培养基(如小米、大米、玉米粒或麸皮)上扩大培养。

3 种子制备
其目的是使孢子发芽、繁殖以获得足够数量的菌丝，并接种到发酵罐中，种子制备可用摇瓶培养后再接人种子罐进逐级扩大培养。

或直接将孢子接人种子罐后逐级放大培养。

种子扩大培养级数的多少，决定于菌种的性质、生产规模的大小和生产工艺的特点。

扩大培养级数通常为二级。

摇瓶培养是在锥形瓶内装入一定数量的液体培养基，灭菌后以无菌操作接入孢子，放在摇床上恒温培养。

在种子罐中培养时，在接种前有关设备和培养基都必须经过灭菌。

接种材料为孢子悬浮液或来自摇瓶的菌丝，以微孔差压法或打开接种口在火焰保护下按种。

接种量视需要而定。

在罐内培养过程中，需要搅拌和通人无菌空气。

控制罐温、罐压，并定时取样作无菌试验，观察菌丝形态，测定种子液中发酵单位和进行生化分析等，并观察无杂菌情况。

种子质量如合格方可移种到发酵罐中。

4、发酵过程控制
反复分批式发酵，100m3发酵罐，装料80m3，带放6－10次，间隔24h。

带放量10％，发酵时间204h。

发酵过程需连续流加补入葡萄糖、硫酸铵以及前体物质苯乙酸盐，补糖率是最关键的控制指标，不同时期分段控制。

在青霉素的生产中，让培养基中的主要营养物只够维持青霉菌在
前40h生长，而在40h后，靠低速连续补加葡萄糖和氮源等，使菌半饥饿，延长青霉素的合成期，大大提高了产量。

所需营养物限量的补加常用来控制营养缺陷型突变菌种，使代谢产物积累到最大。

1 培养基
青霉素发酵中采用补料分批操作法，对葡萄糖、铵、苯乙酸进行缓慢流加，维持一定的最适浓度。

葡萄糖的流加，波动范围较窄，浓度过低使抗生素合成速度减慢或停止，过高则导致呼吸活性下降，甚至引起自溶，葡萄糖浓度调节是根据pH，溶氧或CO2释放率予以调节。

碳源的选择：生产菌能利用多种碳源，乳糖，蔗糖，葡萄糖，阿拉伯糖，甘露糖，淀粉和天然油脂。

经济核算问题，生产成本中碳源占12％以上，对工艺影响很大；糖与6-APA结合形成糖基-6-APA，影响青霉素的产量。

葡萄糖、乳糖结合能力强，而且随时间延长而增加。

通常采用葡萄糖和乳糖。

发酵初期，利用快效的葡萄糖进行菌丝生长。

当葡萄糖耗竭后，利用缓效的乳糖，使pH稳定，分泌青霉素。

可根据形态变化，滴加葡萄糖，取代乳糖。

目前普遍采用淀粉的酶水解产物，葡萄糖化液流加。

降低成本。

氮源：玉米浆是最好的，是玉米淀粉生产时的副产品，含有多种氨基酸及其前体苯乙酸和衍生物。

玉米浆质量不稳定，可用花生饼粉或棉籽饼粉取代。

补加无机氮源。

无机盐：硫、磷、镁、钾等。

铁有毒，控制在30µg/ml以下。

流加控制：补糖，根据残糖、pH、尾气中CO2和O2含量。

残糖在0.6％左右，pH开始升高时加糖。

补氮：流加酸酸铵、氨水、尿素，控制氨基氮0.05%。

添加前体：合成阶段，苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可为青霉素侧链的前体，直接掺入青霉素分子中。

也具有刺激青霉素合成作用。

但浓度大于0.19％时对细胞和合成有毒性。

还能被细胞氧化。

策略是流加低浓度前体，一次加入量低于0.1%，保持供应速率略大于生物合成的需要。

2 温度
一生长适宜温度30℃，分泌青霉素温度20℃。

但20℃青霉素破坏少，周期很长。

生产中采用变温控制，不同阶段不同温度。

前期控制25－26℃左右，后期降温控制23℃。

过高则会降低发酵产率，增加葡萄糖的维持消耗，降低葡萄糖至青霉素的转化得率。

有的发酵过程在菌丝生长阶段采用较高的温度，以缩短生长时间，生产阶段适当降低温度，以利于青霉素合成。

3 pH
合成的适宜pH6.4－6.6左右，避免超过7.0，青霉素在碱性条件下不稳定，易水解。

缓冲能力弱的培养基，pH降低，意味着加糖率过高造成酸性中间产物积累。

pH上升，加糖率过低不足以中和蛋白产生的氨或其他生理碱性物质。

前期pH控制在 5.7~6.3，中后期pH控制6.3~6.6，通过补加氨水进行调节。

pH较低时，加入CaCO3、通氨调节
或提高通气量。

pH上升时，加糖或天然油脂。

一般直接加酸或碱自动控制，流加葡萄糖控制。

4 溶氧
溶氧＜30％饱和度，产率急剧下降，低于10％，则造成不可逆的损害。

所以不能低于30％饱和溶氧浓度。

通气比一般为1：0.8VVM。

溶氧过高，菌丝生长不良或加糖率过低，呼吸强度下降，影响生产能力的发挥。

适宜的搅拌速度，保证气液混合，提高溶氧，根据各阶段的生长和耗氧量不同，对搅拌转速调整。

5 菌丝生长速度与形态、浓度
对于每个有固定通气和搅拌条件的发酵罐内进行的特定好氧过程，都有一个使氧传递速率（OTR）和氧消耗率（OUR）在某一溶氧水平上达到平衡的临界菌丝浓，超过此浓度，OUR＞OTR，溶氧水平下降，发酵产率下降。

在发酵稳定期，湿菌浓可达15~20%，丝状菌干重约3%，球状菌干重在5%左右。

另外，因补入物料较多，在发酵中后期一般每天带放一次，每次放掉总发酵液的10%左右。

有丝状生长和球状生长两种。

前者由于所有菌丝体都能充分和发酵液中的基质及氧接触，比生产率高，发酵粘度低，气/液两相中氧的传递率提高，允许更多菌丝生长。

球状菌丝形态的控制，与碳、氮源的流加状况，搅拌的剪切强度及稀释度相关。

6 消沫
发酵过程泡沫较多，需补入消沫剂。

天然油脂：玉米油；化学消沫剂：泡敌。

少量多次,不适在前期多加入，影响呼吸代谢。

青霉素的发酵过程控制十分精细，一般2 h取样一次，测定发酵液的pH、菌浓、残糖、残氮、苯乙酸浓度、青霉素效价等指标，同时取样做无菌检查，发现染菌立即结束发酵，视情况放过滤提取，因为染菌后pH值波动大，青霉素在几个小时内就会被全部破坏。

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