重症监护室耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的耐药机制和同源性分析

各 １ μＬ，无菌去离子水 ９．５ μＬ，模板１ μＬ。反应体
系： 预变性 ； 变性 ， 退 ９５ ℃
５ ｍｉｎ ９５ ℃ １ ｍｉｎ ５５ ～ ６８ ℃
火 １ ， ｍｉｎ ７２ ℃ 延伸 １ ， ｍｉｎ ３５ 个循环；７２ ℃ 延伸
基金项目：国家自然科学基金（８１１７１６０６）。 作者简介：宋国滨，１９９４ 年生，男，硕士研究生，研究方向为临床微生物检验和耐药机制研究。 通信作者：徐元宏，教授，主任技师，博士研究生导师，从事临床微生物学研究，Ｅｍａｉｌ：ｘｙｈｏｎｇ１９６４＠ 。 １６３．ｃｏｍ
测定临床常见抗菌药物的敏感性，用 Ｃａｒｂａ ＮＰ 试验对碳青霉烯酶进行筛选，同时对超广谱 β内酰胺酶（ＥＳＢＬｓ）、头孢菌素酶
（ＡｍｐＣ 酶）、碳青霉烯酶基因进行 ＰＣＲ 扩增和序列分析，用基质辅助激光解吸电离飞行质谱（ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ）技术及多位点
序列分型（ＭＬＳＴ）进行同源性分析。结果 ＰＣＲ 检测基因型显示 ３６ 株 ＣＲＫＰ 以产 ＫＰＣ２ 型酶为主，部分菌株同时拥有 ＥＳＢＬ
。 ， ， 、 、 、 和 耐药基因 将 株 分为 大簇 结果显示 株菌均为 型 ＡｍｐＣ
ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ ３９ ＣＲＫＰ
３
ＭＬＳＴ
３５
ＳＴ１１ ＳＴ３７９ ＳＴ７５１ ＳＴ３０７
ＳＴ４９０ 各有 １ 株，经 ｅＢＵＲＳＴ 在线软件分析 ＳＴ１１ 与 、 ＳＴ３７９ ＳＴ７５１ 的亲缘关系较近，来源于同一克隆株。结论 ４ 个 ＩＣＵ 病房
林贸易有分离划线于血平
板，长出菌落后，用 Ｖｉｔｅｋ 质谱仪重新鉴定。采用纸
片扩散（ＫＢ）法及 Ｖｉｔｅｋ ２ Ｃｏｍｐａｃｔ 仪器法进行药敏
试验，结果判读及解释根据 ２０１８ 年美国临床和实验
室标准化协会（ＣＬＳＩ）文件进行。
１．４ 试验 Ｃａｒｂａ ＮＰ 参照文献［２］进行。
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临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ， ， ， ２０１９ ４ ３７ ４ Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｓｃｉ Ａｐｒ． ２０１９ Ｖｏｌ．３７ Ｎｏ．４
１０ ｍｉｎ，最后于 ４ ℃保存。取扩增产物行 １５ ｇ／ Ｌ 琼 脂糖凝胶电泳，并将扩增阳性产物送上海生工公司 进行测序，测序结果与 ＮＣＢＩ 数据库比对，从而确定 耐药基因亚型。
临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ， ， ， ２０１９ ４ ３７ ４ Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｓｃｉ Ａｐｒ． ２０１９ Ｖｏｌ．３７ Ｎｏ．４
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： ＤＯＩ １０．１３６０２ ／ ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｃｌｓ．２０１９．０４．１０
·临床实验研究·
重症监护室耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的耐药机制和同源性分析
琼脂糖、引物（合成）购自上海生工生物公司；ＤＮＡ
、 （日本 公司）； ｍａｒｋｅｒ Ｐｒｅｍｉｘ ＴａｑＴＭ
ＴａＫａＲａ
Ｖｉｔｅｋ ＭＳ
ＣＨＣＡ 基质液（法国生物梅里埃公司）；药敏试验纸
片（英国 Ｏｘｏｉｄ 公司）；哥伦比亚血平板（合肥天达
诊断试剂有限公司）；ＭｕｌｌｅｒＨｉｎｔｏｎ 琼脂（江门市凯
１．２ 仪器与试剂 高速冷冻离心机（中国 ｈｅａｌ ｆｏｒｃｅ
公司）；ＧｅｎｅＡｍｐ９７０ 基因扩增仪（美国 ＰＥ 公司）；
ＣＲａ８ｄ８公０Ｖ司Ｃ）Ｏ；２Ｖ孵ｉｔｅ箱ｋ 、２紫Ｃｏ外ｍｐ线ａｃ凝ｔ 全胶自成动像细系菌统鉴（定美及国药Ｂｉ敏ｏ
分析系统、Ｖｉｔｅｋ 质谱仪（法国生物梅里埃公司）。
中 ＣＲＫＰ 以产 ＫＰＣ２ 型酶为主，是 ＣＲＫＰ 对碳青霉烯类抗菌药物耐药的主要机制。３７ 株 ＣＲＫＰ 高度同源，提示不同 ＩＣＵ 病房
间应进一步加强感染控制。
关键词：基质辅助激光解吸电离飞行质谱技术；多位点序列分型；肺炎克雷伯菌
中图分类号：Ｒ４４６．５ 文献标志码：Ａ
肺炎克雷伯菌是引起临床感染常见的致病菌之 一，主要引起呼吸道、泌尿道、创口、胸腔积液和血流 的感染。近年来，随着临床大量应用抗菌药物，尤其 是碳青霉烯类抗菌药物的广泛使用，耐碳青霉烯类 肺炎克雷伯菌（ｃａｒｂａｐｅｎｅｍｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕ ， ｍｏｎｉａｅ ＣＲＫＰ）已在国内广泛流行，引起临床医生 的高度重视。ＣＲＫＰ 除对以亚胺培南、美罗培南为 代表的碳青霉烯类抗菌药物耐药外，对青霉素类、头 孢菌素类、氨基糖苷类、喹诺酮类抗菌药物也具有耐 药性，呈现多重耐药的现象［１］。本研究对我院 ４ 个 重症监护室（ＩＣＵ）病房中收集的 ３９ 株 ＣＲＫＰ 的耐 药性及耐药机制进行分析，同时分析菌株之间的同 源性，为医院感染预防提供依据。
宋国滨，黄颖，徐元宏（安徽医科大学第一附属医院检验科，合肥 ２３００２２ ）
摘要：目的 探讨安徽医科大学第一附属医院 ４ 个重症监护室（ＩＣＵ）中耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（ＣＲＫＰ）的耐药机制和流
行状况，为医院感染控制提供依据。方法 收集 ４ 个 ＩＣＵ 病房中 ＣＲＫＰ 菌株 ３９ 株，采用纸片扩散法和 Ｖｉｔｅｋ ２ Ｃｏｍｐａｃｔ 仪器法
１．５ 耐药基因检测［３５］ 煮沸法提取细菌基因组
ＤＮＡ，以此作为扩增模板，分别扩增碳青霉烯酶、超
广谱 β内酰胺酶（ＥＳＢＬｓ）、ＡｍｐＣ 酶耐药基因，其耐
药基因类型及引物序列见表 １。反应体系为 ２５ ， μＬ
包括 ，上、下游引物（ ） Ｐｒｅｍｉｘ Ｔａｑ １２．５ μＬ
１０ μｍｏｌ ／ Ｌ
１ 材料与方法
１．１ 菌株来源 收集安徽医科大学第一附属医院 检验科 ２０１８ 年 １ 月至 ６ 月保存的来源于 ＩＣＵ 的 ＣＲＫＰ 共 ３９ 株，其中 ＩＣＵ 病房 １７ 株，急诊 ＩＣＵ １７ 株，干部病房 ＩＣＵ ４ 株，心血管外科 ＩＣＵ １ 株。筛选 标准为至少对碳青霉烯类抗菌药物（亚胺培南、美 罗培南、厄他培南）３ 种药物中的 １ 种药物耐药即认 定为 ＣＲＫＰ。剔除同一患者相同部位的重复菌株。 大肠埃希菌 ＡＴＣＣ ８７３９ 为质谱鉴定实验质控菌株， 肺炎克雷伯菌质控细菌 ＡＴＣＣ ７００６０３ 为本实验室 保存。