水产品中硝基呋喃代谢物残留快速检测新方法的研究_李耀平
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1.2 测试条件
1.2.1 超高效液相色谱 分离条件 WatersACQUITY UPLCTM BEH C18 (100 mm ×1.0 mm i.d., 1.7
μm)色谱柱 ;柱温 35 ℃;样品盘温度 22 ℃;流速 0.300 mL/min;流动相 :A液为 5 mmol/L乙酸胺 (含 0.2%甲酸 ), B液为甲醇 ;梯度洗脱 :0 ～ 1 min, 90%A;1 ～ 3.5 min, 90%A～ 20%A;3.5 ～ 4.0 min, 20%A～ 10%A;4.0～ 4.3 min, 10%A;4.3 ～ 4.5 min, 10%～ 90%A。 1.2.2 质谱条件 ESI(+)正离子化模式 ;萃取锥孔电压 5.00 V;雾化气温度 :400 ℃;雾化气流速 803 L/h;反吹气流速 45 L/h;离子源温度 120 ℃;毛细管电压 2.0 kV。 蠕动泵注射进样 , 串联质谱检 测 。对各衍生产物的一级质谱和二级质谱扫描 , 优化确定定性定量监测离子对的质谱参数 (见表 1)。
第 7期
李耀平等 :水产品中硝基呋喃代谢物残留快速检测新方法的研究
713
助性的应用实验 , 或只对 3-氨基 -2-唑烷基酮 (AOZ)和 5-甲基吗啉 -3-氨基 -2-唑烷基酮 (AMOZ)等个别硝 基呋喃代谢物进行初步研究 , 远未达到可实际检测应用的水平 。
本文采用超高效液相色谱串联质谱系统 , 研究了以常用衍生剂 2-硝基苯甲醛和新衍生剂 2-氯苯甲 醛对硝基呋喃代谢物的快速衍生化反应机制 、 衍生化产物的检测灵敏度及其稳定性 , 以探寻缩短水解 衍生时间的技术与途径 , 为水产品中硝基呋喃代谢物快速检测新方法的建立提供理论依据 。
硝基呋喃类药物主要包括呋喃唑酮 、 呋喃西林 、 呋喃它酮 、 呋喃妥因 , 已被大多数国家禁止在动 物源性食品上使用 。 根据欧盟指令 , 硝基呋喃代谢物残留检测方法的检出限性能要求 (MRPL)为 1.0 μg/kg;其质谱确证方法必须具有 4个鉴别点 。 当前国际上普遍采用液相色谱 -串联质谱法进行硝基呋 喃代谢物的检测和确证[ 1 -8] 。 水解和衍生化是质谱方法检测硝基呋喃代谢物的关键步骤之一 , 常用的 衍生剂是 2-硝基苯甲醛 , 衍生反应时间长达 16 h。 有人尝试使用吡啶 -3-羰基甲醛 、 2, 4-二硝基苯甲 醛 、 2-羟基 -5-硝基苯甲醛等其他芳香醛类化合物为衍生剂 , 但没有明显提高灵敏度或缩短反应时间 [ 4] 。 少数文献报道[ 1-2] 采用 2-氯苯甲醛 (2-chlorobenzaldehyde, 2-CPA)为衍生剂 , 但只在单级质谱上进行辅
＊quantitativeionpair(定量离子对 );＊＊isotope-labeledinternalstandard, I.S.(同位素内标 )
Conevolt
U/V 30.0 30.0 21.0 21.0 22.0 22.0 25.0 25.0 23.0 23.0 22.0 22.0 20.0 20.0 30.0 30.0
Mr 225
CPAOZ D4
229
CPAMOZ 324
CPAMOZ D
5
329
CPSEM
198
CPSEM 13C15N
2
201
CPAHD
238
CPAHD 13 C3 241
NPAOZ
236
NPAOZ D
4
240
NPAMOZ 335
NPAMOZ D5 340
NPSEM
209
NPSEM 13C15 N2 212
硝基呋喃类代谢物快速检测 试剂盒包括固 体提取剂 、 液 体提取剂 、 衍生剂 、 衍生 催化剂 、 快 速 SPE净化柱 , 由中国检验检疫科学研究院提供 。
标准品及其内标物储备溶液配制 :准确称取上述 AOZ、 AMOZ、 SEM、 AHD标准品及其同位素内 标 AOZD4 、 AMOZD5 、 SEM 13 C15 N2 、 AHD 13 C3 , 分别用甲醇溶解 、 定容于 100 mL容量瓶中 , 配制 成 100 mg/L的标准储备液 。 使用时 , 用甲醇或 10%(体积分数 )甲醇水溶液逐级稀释到使用浓度 。
标准品及同位素内标 :盐酸氨基脲 (SEM· HCl)、 3-氨基 -2-唑烷基酮 (AOZ)、 5-甲基吗啉 -3-氨基 2-唑烷基酮 (AMOZ)、 盐酸 1-氨基 -乙内酰脲 (AHD· HCl)。 内标物 :AOZ D4 、 AHD 13 C3 、 AMOZ D5 、 SEM 13 C15 N2 · HCl。上述标准品及同位素内标均为进口 , 纯度均不小于 99%, 德国 WitegaLaboratorien Berlin-AdlershofGmbH产品 。
AResearchtoEstablishaNewQuickDeterminationof NitrofuranMetaboliteResiduesinAquaticProducts
LIYao-ping1 , LINYong-hui1 , JIADong-fen2 , YANGFang1 , YUKong-jie1 , LIUZheng-cai1 , WANGYa-jun2, CAIChun-ping1
NPAHD
249
NPAHD 13 C3 252
Monitoห้องสมุดไป่ตู้ingionpair
(Precursor>Product)m/z 225 >138＊ , 225 >125 229 >138 324 >280＊ , 324 >251 329 >285 198 >138, 198 >181＊ 201 >184 238 >167＊ , 238 >138 241 >168 236 >134＊ , 236 >104 240 >134 335 >262, 335 >291＊ 340 >297 209 >166＊ , 209 >192 212 >168 249 >134＊ , 249 >178 252 >134
(1.FujianExit-EntryInspectionandQurantineBureau, Fuzhou 350001, China; 2.ChineseAcademyofInspectionandQuarantine, Beijing 100025, China)
Abstract:Thederivatizationmechanisms, thesensitivitiesandstabilitiesofthederivativesof4 nitrofuranmetabolitesderivatisedwith2 reagents, 2-chlorobenzaldehydeand2-nitrobenzaldehyde, with derivatisationtimeof2 and16 hourswerestudied, respectively, byaUPLC-MS/MSsystemtodevelopaquickanalyticalmethodforaquaticproducts.MSandMS-MSdataindicatedthatbothderivatizationreactionswith2-chlorobenzaldehydeand2-nitrobenzaldehydeinvolvedanucleophilicadditionreaction.Meansquareanalysisshowedtherewerenoevidentdifferencesinsensitivitiesbetween derivatisationfor2 hoursandfor16 hoursgiventhesamederivatisationreagentandthesamemetabolite, whilesensitivitiesofallthequickderivatisationswererelativelystablewithin4 days.ApremilinaryresearchofthevalidityofrapidhydrolysisonthereleaseofAOZandSEM frominccurredsampleswasalsocarriedout. Keywords:nitrofuranmetabolites;derivatization;quickdetermination;UPLC-MS/MS;2-nitrobenzaldehyde;2-chlorobenzaldehyde
(1.福建出入境检验检疫局 , 福建 福州 350001;2.中国检验检疫科学研究院 , 北京 100025)
摘 要 :采用超高效液相色谱 -串联质谱检测系统 (UPLC-MS/MS)研究了 2种衍生剂 、 2种衍生时间对水产 品中 4种硝 基 呋 喃 代 谢 物 3-氨 基 -2-唑 烷 基 酮 (AOZ)、 5-甲 基 吗 啉 -3-氨 基 -2-唑 烷 基 酮 (AMOZ)、 氨 基 脲 (SEM)、 1-氨基 -乙丙酰脲 (AHD)的衍生化反应机理 、 衍生产 物的 检测灵 敏度 及其稳 定性 。 质谱扫 描结 果表 明 , 衍生剂 2-氯苯甲醛和 2-硝基苯甲醛对 4种硝基呋喃代谢物的 衍生化反应 遵循相 同的亲 核加成 反应机 理 ; 方差分析结果表明 , 同一衍生剂 和同一代谢物 , 快速衍生化 2 h和连续衍生化 16 h获得的衍生产物的 检测灵 敏度没有显著差别 ;所有快速衍 生物检测灵敏度连续 4 d保持相对 稳定 。 初步研 究了快速水 解对阳性 样品的 有效性 。 关键词 :硝基呋喃代谢物 ;衍生化 ;快速检测 ;超高效液相 色谱 -串联质谱 ;2-硝基苯甲醛 ; 2-氯苯甲醛 中图分类号:O657.63;F762.6;R978.2 文献标识码 :A 文章编号 :1004-4957(2008)07 -0712 -06
第 27 卷 第 7期 2008 年 7月
FENXICESHIXUEBA分O析(J测ou试rna学l报 ofInstrumentalAnalysis) Vo7l. 122～7
No.7 717
水产品中硝基呋喃代谢物残留快速检测 新方法的研究
李耀平1 , 林永辉1 , 贾东芬2, 杨 方1 , 余孔捷1 , 刘正才1 , 王亚军2, 蔡春平1
AMOZ D＊ 5＊
206
SEM
75
SEM 13C15N＊＊
2
78
AHD
115
AHD 13 C＊ 3＊
118
AOZ
102
AOZ D4 ＊＊
106
AMOZ
201
AMOZ D＊ 5＊
206
SEM
75
SEM 13C15N＊ 2＊
78
AHD
115
AHD 13 C＊ 3＊
118
Derivatives
Name CPAOZ
收稿日期 : 2007 -10 -16;修回日期 :2007 -11 -20 基金项目 :福建省科技计划重点项目 (2006N0001) 第一作者 :李耀平 (1963 -), 男 , 福建东山人 , 高级工程师 , 硕士 , Tel: 0591 -87065545, E-mail:lypfjfz2007@
表 1 硝基呋喃代谢物质谱测定参数 Table1 MSparametersfordeterminationofderivativesofnitrofuranmetabolites
Reagents 2-CPA
2-NPA
Metabolites
Name AOZ
Mr 102
AOZ D＊ 4＊
106
AMOZ
201
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
ACQUITYUPLC-MicromassQuattroPremierXE超高效液相色谱 -串联质谱系统 , 三重四极杆 质 谱 , 配电喷雾电离源 , 雾化气 、 反吹气气源为氮气 , 碰撞气气源为氦气 。
实验用水 :重蒸馏水 ;盐酸 、 氢氧化钠 , 分析纯 ;乙腈 、 甲醇 、 乙酸铵 、 甲酸 , 色谱纯 ;衍生化 试剂 :2-氯苯甲醛 (德国 , Sigma-AldrichChemieGmbH产品 )、 2-硝基苯甲醛 (USA, Amresco产品 )。
1.2.1 超高效液相色谱 分离条件 WatersACQUITY UPLCTM BEH C18 (100 mm ×1.0 mm i.d., 1.7
μm)色谱柱 ;柱温 35 ℃;样品盘温度 22 ℃;流速 0.300 mL/min;流动相 :A液为 5 mmol/L乙酸胺 (含 0.2%甲酸 ), B液为甲醇 ;梯度洗脱 :0 ～ 1 min, 90%A;1 ～ 3.5 min, 90%A～ 20%A;3.5 ～ 4.0 min, 20%A～ 10%A;4.0～ 4.3 min, 10%A;4.3 ～ 4.5 min, 10%～ 90%A。 1.2.2 质谱条件 ESI(+)正离子化模式 ;萃取锥孔电压 5.00 V;雾化气温度 :400 ℃;雾化气流速 803 L/h;反吹气流速 45 L/h;离子源温度 120 ℃;毛细管电压 2.0 kV。 蠕动泵注射进样 , 串联质谱检 测 。对各衍生产物的一级质谱和二级质谱扫描 , 优化确定定性定量监测离子对的质谱参数 (见表 1)。
第 7期
李耀平等 :水产品中硝基呋喃代谢物残留快速检测新方法的研究
713
助性的应用实验 , 或只对 3-氨基 -2-唑烷基酮 (AOZ)和 5-甲基吗啉 -3-氨基 -2-唑烷基酮 (AMOZ)等个别硝 基呋喃代谢物进行初步研究 , 远未达到可实际检测应用的水平 。
本文采用超高效液相色谱串联质谱系统 , 研究了以常用衍生剂 2-硝基苯甲醛和新衍生剂 2-氯苯甲 醛对硝基呋喃代谢物的快速衍生化反应机制 、 衍生化产物的检测灵敏度及其稳定性 , 以探寻缩短水解 衍生时间的技术与途径 , 为水产品中硝基呋喃代谢物快速检测新方法的建立提供理论依据 。
硝基呋喃类药物主要包括呋喃唑酮 、 呋喃西林 、 呋喃它酮 、 呋喃妥因 , 已被大多数国家禁止在动 物源性食品上使用 。 根据欧盟指令 , 硝基呋喃代谢物残留检测方法的检出限性能要求 (MRPL)为 1.0 μg/kg;其质谱确证方法必须具有 4个鉴别点 。 当前国际上普遍采用液相色谱 -串联质谱法进行硝基呋 喃代谢物的检测和确证[ 1 -8] 。 水解和衍生化是质谱方法检测硝基呋喃代谢物的关键步骤之一 , 常用的 衍生剂是 2-硝基苯甲醛 , 衍生反应时间长达 16 h。 有人尝试使用吡啶 -3-羰基甲醛 、 2, 4-二硝基苯甲 醛 、 2-羟基 -5-硝基苯甲醛等其他芳香醛类化合物为衍生剂 , 但没有明显提高灵敏度或缩短反应时间 [ 4] 。 少数文献报道[ 1-2] 采用 2-氯苯甲醛 (2-chlorobenzaldehyde, 2-CPA)为衍生剂 , 但只在单级质谱上进行辅
＊quantitativeionpair(定量离子对 );＊＊isotope-labeledinternalstandard, I.S.(同位素内标 )
Conevolt
U/V 30.0 30.0 21.0 21.0 22.0 22.0 25.0 25.0 23.0 23.0 22.0 22.0 20.0 20.0 30.0 30.0
Mr 225
CPAOZ D4
229
CPAMOZ 324
CPAMOZ D
5
329
CPSEM
198
CPSEM 13C15N
2
201
CPAHD
238
CPAHD 13 C3 241
NPAOZ
236
NPAOZ D
4
240
NPAMOZ 335
NPAMOZ D5 340
NPSEM
209
NPSEM 13C15 N2 212
硝基呋喃类代谢物快速检测 试剂盒包括固 体提取剂 、 液 体提取剂 、 衍生剂 、 衍生 催化剂 、 快 速 SPE净化柱 , 由中国检验检疫科学研究院提供 。
标准品及其内标物储备溶液配制 :准确称取上述 AOZ、 AMOZ、 SEM、 AHD标准品及其同位素内 标 AOZD4 、 AMOZD5 、 SEM 13 C15 N2 、 AHD 13 C3 , 分别用甲醇溶解 、 定容于 100 mL容量瓶中 , 配制 成 100 mg/L的标准储备液 。 使用时 , 用甲醇或 10%(体积分数 )甲醇水溶液逐级稀释到使用浓度 。
标准品及同位素内标 :盐酸氨基脲 (SEM· HCl)、 3-氨基 -2-唑烷基酮 (AOZ)、 5-甲基吗啉 -3-氨基 2-唑烷基酮 (AMOZ)、 盐酸 1-氨基 -乙内酰脲 (AHD· HCl)。 内标物 :AOZ D4 、 AHD 13 C3 、 AMOZ D5 、 SEM 13 C15 N2 · HCl。上述标准品及同位素内标均为进口 , 纯度均不小于 99%, 德国 WitegaLaboratorien Berlin-AdlershofGmbH产品 。
AResearchtoEstablishaNewQuickDeterminationof NitrofuranMetaboliteResiduesinAquaticProducts
LIYao-ping1 , LINYong-hui1 , JIADong-fen2 , YANGFang1 , YUKong-jie1 , LIUZheng-cai1 , WANGYa-jun2, CAIChun-ping1
NPAHD
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NPAHD 13 C3 252
Monitoห้องสมุดไป่ตู้ingionpair
(Precursor>Product)m/z 225 >138＊ , 225 >125 229 >138 324 >280＊ , 324 >251 329 >285 198 >138, 198 >181＊ 201 >184 238 >167＊ , 238 >138 241 >168 236 >134＊ , 236 >104 240 >134 335 >262, 335 >291＊ 340 >297 209 >166＊ , 209 >192 212 >168 249 >134＊ , 249 >178 252 >134
(1.FujianExit-EntryInspectionandQurantineBureau, Fuzhou 350001, China; 2.ChineseAcademyofInspectionandQuarantine, Beijing 100025, China)
Abstract:Thederivatizationmechanisms, thesensitivitiesandstabilitiesofthederivativesof4 nitrofuranmetabolitesderivatisedwith2 reagents, 2-chlorobenzaldehydeand2-nitrobenzaldehyde, with derivatisationtimeof2 and16 hourswerestudied, respectively, byaUPLC-MS/MSsystemtodevelopaquickanalyticalmethodforaquaticproducts.MSandMS-MSdataindicatedthatbothderivatizationreactionswith2-chlorobenzaldehydeand2-nitrobenzaldehydeinvolvedanucleophilicadditionreaction.Meansquareanalysisshowedtherewerenoevidentdifferencesinsensitivitiesbetween derivatisationfor2 hoursandfor16 hoursgiventhesamederivatisationreagentandthesamemetabolite, whilesensitivitiesofallthequickderivatisationswererelativelystablewithin4 days.ApremilinaryresearchofthevalidityofrapidhydrolysisonthereleaseofAOZandSEM frominccurredsampleswasalsocarriedout. Keywords:nitrofuranmetabolites;derivatization;quickdetermination;UPLC-MS/MS;2-nitrobenzaldehyde;2-chlorobenzaldehyde
(1.福建出入境检验检疫局 , 福建 福州 350001;2.中国检验检疫科学研究院 , 北京 100025)
摘 要 :采用超高效液相色谱 -串联质谱检测系统 (UPLC-MS/MS)研究了 2种衍生剂 、 2种衍生时间对水产 品中 4种硝 基 呋 喃 代 谢 物 3-氨 基 -2-唑 烷 基 酮 (AOZ)、 5-甲 基 吗 啉 -3-氨 基 -2-唑 烷 基 酮 (AMOZ)、 氨 基 脲 (SEM)、 1-氨基 -乙丙酰脲 (AHD)的衍生化反应机理 、 衍生产 物的 检测灵 敏度 及其稳 定性 。 质谱扫 描结 果表 明 , 衍生剂 2-氯苯甲醛和 2-硝基苯甲醛对 4种硝基呋喃代谢物的 衍生化反应 遵循相 同的亲 核加成 反应机 理 ; 方差分析结果表明 , 同一衍生剂 和同一代谢物 , 快速衍生化 2 h和连续衍生化 16 h获得的衍生产物的 检测灵 敏度没有显著差别 ;所有快速衍 生物检测灵敏度连续 4 d保持相对 稳定 。 初步研 究了快速水 解对阳性 样品的 有效性 。 关键词 :硝基呋喃代谢物 ;衍生化 ;快速检测 ;超高效液相 色谱 -串联质谱 ;2-硝基苯甲醛 ; 2-氯苯甲醛 中图分类号:O657.63;F762.6;R978.2 文献标识码 :A 文章编号 :1004-4957(2008)07 -0712 -06
第 27 卷 第 7期 2008 年 7月
FENXICESHIXUEBA分O析(J测ou试rna学l报 ofInstrumentalAnalysis) Vo7l. 122～7
No.7 717
水产品中硝基呋喃代谢物残留快速检测 新方法的研究
李耀平1 , 林永辉1 , 贾东芬2, 杨 方1 , 余孔捷1 , 刘正才1 , 王亚军2, 蔡春平1
AMOZ D＊ 5＊
206
SEM
75
SEM 13C15N＊＊
2
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AHD
115
AHD 13 C＊ 3＊
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AOZ
102
AOZ D4 ＊＊
106
AMOZ
201
AMOZ D＊ 5＊
206
SEM
75
SEM 13C15N＊ 2＊
78
AHD
115
AHD 13 C＊ 3＊
118
Derivatives
Name CPAOZ
收稿日期 : 2007 -10 -16;修回日期 :2007 -11 -20 基金项目 :福建省科技计划重点项目 (2006N0001) 第一作者 :李耀平 (1963 -), 男 , 福建东山人 , 高级工程师 , 硕士 , Tel: 0591 -87065545, E-mail:lypfjfz2007@
表 1 硝基呋喃代谢物质谱测定参数 Table1 MSparametersfordeterminationofderivativesofnitrofuranmetabolites
Reagents 2-CPA
2-NPA
Metabolites
Name AOZ
Mr 102
AOZ D＊ 4＊
106
AMOZ
201
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
ACQUITYUPLC-MicromassQuattroPremierXE超高效液相色谱 -串联质谱系统 , 三重四极杆 质 谱 , 配电喷雾电离源 , 雾化气 、 反吹气气源为氮气 , 碰撞气气源为氦气 。
实验用水 :重蒸馏水 ;盐酸 、 氢氧化钠 , 分析纯 ;乙腈 、 甲醇 、 乙酸铵 、 甲酸 , 色谱纯 ;衍生化 试剂 :2-氯苯甲醛 (德国 , Sigma-AldrichChemieGmbH产品 )、 2-硝基苯甲醛 (USA, Amresco产品 )。