银耳多糖的制备及一般鉴定

银耳多糖的制备及一般鉴定
【实验目的】
1．学习真菌多糖类的分离、纯化原理。

2．学习多糖类物质的一般鉴定方法。

3. 掌握真菌多糖类粗提取的具体步骤及相应原理。

【实验原理】
银耳是我国传统的一种珍贵药用真菌，具有滋补强壮、扶正固本之功效。

银耳中含有的多糖类物质则具有明显提高机体免疫功能、抗炎症和抗放射等作用。

提取与纯化动植物中存在的多糖或微生物胞内多糖，因其细胞或组织外大多有脂质包围，要使多糖释放出来，第一步就是去除表面脂质, 常用醇或醚回流脱脂。

第二步将脱脂后的残渣以水为主体的溶液提取多糖，这样提取得到的多糖提取液含有许多杂质。

杂质主要是无机盐，低分子量的有机物质及高分子量的蛋白质、木质素等。

第三步则要除去这些杂质，对于无机盐及低分子量的有机物质可用透析法、离子交换树脂或凝胶过滤法除去；对于大分子杂质可用酶消化(如蛋白酶．木质素酶) ，乙醇或丙酮等溶剂沉淀法或金属络合物法。

多糖提取液中除去蛋白质是一个很重要的步骤，常用方法有S e v a g e法、三氯乙酸法、酶解法、三氟三氯乙烷法等。

（1）S e v a g e法是除蛋白的经典方法，主要是利用蛋白质在氯仿中变性的特点，用氯仿:正丁醇=5:1或4:1的二元溶剂体系按1:5加入到多糖提取液中，混合物经剧烈振摇后离心，蛋白质与氯仿-正丁醇生成凝胶物而分离，分去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质。

（2）三氯乙酸法利用三氯乙酸，在低温下搅拌加入到多糖提取液中，直到溶液不再继续混浊为止离心弃沉淀，即可达到脱蛋白的目的。

存在于溶液中的三氯乙酸经中和后，通过透析或超滤等方法除去。

（3）酶解法提取是根据植物细胞壁的构成，利用酶反应所具有高度专一性的特点，选择相应的酶，将细胞壁的组成成分(纤维素、半纤维素和果胶质)水解或降解，破坏细胞壁结构，使细胞内的成分溶解、混悬或胶溶于溶剂中，从而达到提取目的，且有利于提高成分的提取率。

（4）三氟三氯乙烷法将三氯乙烷按1:1的比例加到多糖提取液中，在低温下搅拌约10min，离心得上层水层，水层继续用上述方法处理几次即得，此法效率较高，但因其易挥发，不宜大量应用。

本实验采用固体法培养获得的银耳子实体，经沸水抽提、三氯甲烷一正丁醇法除蛋白质和乙醇沉淀分离可制得银耳多糖粗品。

然后进行定性和定量测定及杂质含量测定。

【实验方法】
1．提取
1.1 银耳5g，剪碎，放入1000ml烧杯中。

加500 ml蒸馏水，加一匙NaHCO3 (可加速溶化)，沸水提取1.5h，同时搅拌。

提取过程中可以少量加水。

1.2 三层纱布过滤，得提取液（约200ml）。

将提取液移至分液漏斗中。

1.3 向提取液中加1/4体积的氯仿：正丁醇溶液（V:V=4:1）。

振摇15min，离心（5 min）。

离心后，溶液分为三层，吸取最上层清液，得到去蛋白的多糖液。

1.4 向去蛋白的多糖液加3倍体积的95%乙醇，玻棒搅拌既得多糖沉淀。

1.5 用乙醇和丙酮分别洗涤沉淀，干燥，得粗提取物。

2．含量测定（未做）
完成以上操作后，将各试管放入沸水中煮10min，然后冷至室温。

在490nm下，测定吸光度，绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品多糖的浓度。

另外以Folin酚法测定银耳多糖样品中蛋白质含量，以紫外分光光度法测定样品中核酸的含量。

【讨论】
实验中，我们首先用沸水提取银耳多糖，并在水中加入一匙碳酸氢钠。

加入少量碱是因为对于银耳多糖这种含有糖醛酸的中性多糖，它们在碱液中有更高的提取率，但要控制碱的浓度，碱性较强时多糖可能会水解。

在沸水煮银耳提取多糖的1.5小时内，要不停搅拌提取液，以防底部银耳碎片粘于烧杯底部变糊，同时可适量补充水分。

得到银耳多糖的胶体溶液后，用三层纱布过滤可去除大分子溶质从而纯化多糖提取液（黄色透明液体，约200ml）。

用S e v a g e法除蛋白，将氯仿：正丁醇溶液与提取液充分混匀，以使提取液中的蛋白质成分与氯仿：正丁醇溶液充分接触而生成凝胶物，不断振摇分液漏斗后，液体变为白色的乳状液，而不分层。

离心混合液后，可能是因为离心时间不够充分（离心5min），溶液较为清晰的分成了3层，但在多糖层和蛋白层之间，还有变形的、未完全沉淀的蛋白质杂质。

取离心后的上层清液加入95%乙醇后，搅拌即可得乳白色多糖沉淀。

用乙醇和丙酮洗涤多糖沉淀可除去一些大分子杂质，但在洗涤时，由于对多糖沉淀搅拌较重，沉淀团块被打碎，有部分多糖损失。

倒去洗涤液，我们得到了乳白色的多糖团块。

最后，感谢老师为我们提供了这次学习、实践的机会，感谢您们利用周末时间帮助我们完成实验。