HPLC法测定癸氧喹酯壳聚糖-海藻酸钠微囊中药物含量

HPLC法测定癸氧喹酯壳聚糖-海藻酸钠微囊中药物含量鄂伟;张启迪;王君玮;曲志娜;赵思俊;邹明
【摘要】建立癸氧喹酯壳聚糖-海藻酸钠微囊中癸氧喹酯的HPLC含量测定方法.采用破囊液(0.2mol/L NaHCO3和0.06 mol/LNa3C6H5O7· 2H2O,pH=7.8～8.2)对癸氧喹酯壳聚糖-海藻酸钠微囊进行破囊,破囊后用甲醇和三氯甲烷混合溶液(4∶1)超声提取癸氧喹酯.HPLC检测方法采用Agilent ZORBAX 80A Extend-C18色谱柱；以乙腈-0.1％甲酸水溶液(75∶25)为流动相；检测波长为267 nm;流速为1 mL/min.结果表明,所采取的破囊方法破解效率高,微囊破解完全.方法精密度与准确度表明,癸氧喹酯浓度在0.05 ～10 μg/mL的范围内线性关系良好,回归方程为Y=61.768X +2.8814,R2=0.9996.本方法具有操作简便、快速、准确可靠等特点,适合癸氧喹酯壳聚糖-海藻酸钠微囊中药物含量测定.
【期刊名称】《西南农业学报》
【年(卷),期】2013(026)004
【总页数】4页(P1486-1489)
【关键词】高效液相色谱法;癸氧喹酯;壳聚糖-海藻酸钠微囊
【作者】鄂伟;张启迪;王君玮;曲志娜;赵思俊;邹明
【作者单位】青岛农业大学动物科技学院,山东青岛266109;青岛农业大学动物科技学院,山东青岛266109;中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛266032;中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛266032;中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛266032;青岛农业大学动物科技学院,山东青岛266109
【正文语种】中文
【中图分类】R927.2
癸氧喹酯(Decoquinate)是一种喹啉类抗球虫药物，又名地考喹酯，临床上可用来防治鸡的毒害、巨型、柔嫩、堆型、变位和布氏艾美耳球虫等引起的球虫病［1］，其次对隐孢子虫引起的动物腹泻也有一定的缓解和治疗作用。

该药自1967年上市以来，一直被许多国家用于预防肉仔鸡的球虫病［2］。

癸氧喹酯不溶于水及绝大部分有机溶剂，其制剂比较单一，市场上主要是应用其预混剂，这极大限制了癸氧喹酯的临床应用。

本实验室采用药物微囊化技术，以壳聚糖和海藻酸钠为复合囊材，制备癸氧喹酯壳聚糖-海藻酸钠微囊，较好地解决了癸氧喹酯难溶于水的弊端。

目
前仅见有癸氧喹酯预混剂和溶液剂相关检测方法的报道［3～4］，未见有微囊中
癸氧喹酯含量检测方法的报道。

本研究采用化学方法与机械方法相结合的破囊方法，并建立了一种检测癸氧喹酯壳聚糖-海藻酸钠微囊中药物含量的HPLC方法，为制
剂的后续研发及质量评价提供技术支持。

1 材料与方法
1．1 药品及试剂
癸氧喹酯对照品(含量98．5%，德国Dr．Ehrenstorfer公司，批号18507-89-6);癸氧喹酯原料药(含量98．5%，青岛康地恩药业股份有限公司);癸氧喹酯壳聚糖-
海藻酸钠微囊(自制);乙腈、甲醇(色谱纯，德国 Merck公司);甲酸(色谱纯，美国DIKMA 公司);NaHCO3、Na3 C6 H5O7·2H2O、三氯甲烷均为分析纯。

1．2 试验方法
1．2．1 色谱条件色谱柱为Agilent ZORBAX 80A Extend-C18(250 mm ×4．6 mm，5 μm);流动相乙腈－0．1%甲酸水溶液(75∶25);检测波长267 nm;柱温
35℃;流速1 mL/min;进样量20μl。

1．2．2 溶液的配制样品溶剂:准确量取50 mL CHCl3，加甲醇定容至250 mL。

对照品储备液:精密称取癸氧喹酯标准品0．0025 g，置于25 mL容量瓶中，加适量上述样品溶剂超声5 min，使其充分溶解，定容至刻度，摇匀，得终浓度为100μg/mL储备液，－20℃保存备用。

破囊液:精密称取1．72 g NaHCO3和1．84 g Na3 C6 H5O7·2H2O，加超纯水溶解，定容至100 mL。

1．2．3 样品前处理取载药微囊样品，精密称取0．01 g，置于10 mL玻璃离心管中，加1 mL破囊液，涡旋5 min使微囊充分溶解破碎，将溶液转移至100 mL 容量瓶中，加样品溶剂定容至刻度，超声5 min使药物充分溶解。

取10 mL溶液于100 mL容量瓶中，加流动相定容，取一定量样品溶液过0．22μm有机微孔滤膜后装入样品瓶，待测。

1．3 系统适应性与方法专属性试验
1．3．1 系统适应性试验对照品储备液平衡至室温，精密量取1 mL于10 mL容量瓶中，加入样品溶剂定容，配制浓度为10μg/mL的工作液，取一定量工作液用流动相稀释至浓度为2μg/mL，空白溶剂用流动相稀释5倍。

分别精密称取0．01 g空白微囊和载药微囊样品，采用“1．2．3”方法处理。

对照品溶液、空白溶剂、空白微囊样品溶液、载药微囊溶液样品按“1．2．1”条件下进样，记录色谱图。

1．3．2 专属性试验精密称取5份空白微囊样品，每份0．009 g，置于10 mL 玻璃离心管中。

分别准确加入 0．001 g对照品，按“1．2．3”中的破囊方法破囊后，将溶液转移至100 mL容量瓶中，密封。

经强酸(6 mol/L的HCl溶液1 mL避光处理1 h，加入等体积的6 mol/L的 NaOH溶液中止反应)、强碱(6 mol/LNaOH溶液1 mL避光处理1 h，加入等体积的6mol/L的HCl溶液中止反应)、高温(105℃干燥箱中避光放置24 h)、光照(4500±500 lx强光照射10 d)、
氧化(加入 0．2 mL H2O2，避光反应 1 h)处理后加样品溶剂定容至100 mL，充分混匀，用流动相稀释10倍，进样检测，记录色谱图。

1．4 线性关系考察
取一定量工作液，用流动相分别稀释浓度为0．05、0．5、1、2、5、10 μg/mL 的标准溶液。

在“1．2．1”色谱条件下测定6个标准品浓度，以标准液浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标考察线性关系。

1．5 定量限和检测限试验
取线性范围试验项0．5μg/mL溶液，用流动相逐步稀释，降低进样浓度，重复操作6次，以信噪比3∶1和10∶1时的进样量确定最低检测限(LOD)和最低定量限(LOQ)。

1．6 精密度试验
取10、1、0．5 μg/mL 3 个浓度的对照品溶液，各浓度日内重复进样5次，计算日内相对标准偏差;同法各浓度每日测定1次，连续测定5 d，计算日间相对标准偏差。

1．7 回收率的测定
准确称取 0．005、0．008、0．0095 g 空白微球 3份，置于10 mL玻璃离心管中，分别加入癸氧喹酯对照品 0．005、0．002、0．0005 g，相当于 50%、20%、5%的药物含量。

按“1．2．3”方法处理。

同时工作液用流动相稀释，得到5、2、0．5μg/mL的标准溶液。

按“回收率=×100%”式中，A为经处理后微囊中癸氧喹酯峰面积，As为对应标准液中癸氧喹酯峰面积，计算回收率。

1．8 癸氧喹酯壳聚糖-海藻酸钠微囊样品中药物含量测定
取3批次癸氧喹酯微囊样品，精密称取0．01 g，按“1．2．3”中的微囊样品处理方法进行处理，样品溶液上机，每批样品重复测定3次，计算微囊中癸氧喹酯含量。

2 结果与分析
2．1 HPLC方法的建立
2．1．1 系统适应性试验结果结果(图1)显示，癸氧喹酯保留时间为8．3～8．4 min，在267 nm波长条件下，空白辅料和溶剂在此出峰时间处无杂质峰出现。

在该色谱条件下，主峰分离较好，峰型较对称，说明此色谱条件适合于癸氧喹酯微囊中药物含量的测定。

图1 HPLC色谱图Fig．1 HPLC chromatogramsA．癸氧喹酯标准品(2μg/mL)色谱图;B．空白溶剂色谱图;C．空白微囊样品色谱图;D．癸氧喹酯微囊样品色谱图A．Chromatogram of decoquinate standard(2 μg/mL);B．Chromatogram of blank solvent;C．Chromatogram of blank
microcapsules;D．Chromatogram of sample ofmicrocapsules with decoquinate
2．1．2 专属性实验经强酸、强碱、高温、光照、氧化处理后，杂质峰及分解物质峰均能得到很好的分离，对主峰不产生干扰，不影响癸氧喹酯的测定。

2．2 线性关系的考察
结果显示，癸氧喹酯在0．05～10μg/mL浓度范围内线性关系良好，标准曲线方程为 Y=61．768X+2．8814，R2=0．9996。

2．3 定量限与检测限
根据试验测得的药物峰与基线噪音值的比值，按信噪比S/N=3，测得LOD值为0．015μg/mL，按信噪比S/N=10，计算LOQ为0．05μg/mL。

2．4 精密度试验
试验结果(表1～2)表明，该方法测定癸氧喹酯含量精密度高，日内变异系数小于1．17%，日间变异系数小于1．92%，符合方法学要求。

2．5 回收率实验
对添加50%、20%、5%药物水平的空白微囊进行回收率测定，数据(表3)显示，3个浓度的癸氧喹酯样品平均回收率较高，均在98%以上，因此本方法可以用于检定微囊中癸氧喹酯的含量。

2．6 样品中癸氧喹酯含量的测定
数据(表4)显示，3批载药微囊样品中的癸氧喹酯平均含量分别为 7．66%、8．49%、8．04%，说明3批样品中癸氧喹酯含量合格。

表1 日内精密度试验结果(n=5)Table 1 Test results of intra-day variance浓度(μg/mL)Density峰面积Peak area 1 2 3 4 5平均峰面积Average peak area RSD(%)0．5 30．6 29．3 30．7 31．0 30．8 30．5 0．68 1 71．0 73．9 73．7 73．1 72．4 72．8 1．17 10 619．9 619．1 618．3 618．7 619．6 619．1 0．65
表2 日间精密度试验结果(n=5)Table 2 Test results of inter-day variance浓度(μg/mL)Density峰面积Peak area 1 2 3 4 5平均峰面积Average peak area RSD(%)0．5 30．2 30．7 28．4 31．3 31．7 30．5 1．29 1．0 72．8 73．9 73．3 72．4 69．0 72．3 1．92 10．0 619．1 616．0 617．5 620．3 618．3 618．2 1．62
表3 回收率试验结果(n=3)Table 3 Test results of recovery药物含量(%)Drug contents回收率(%)Recovery 1 2 3平均回收率(%)Average recovery
RSD(%)50 99．77 99．44 99．90 99．70 0．24 20 99．40 98．39 98．03 98．61 0．71 5 96．39 100．65 98．01 98．35 2．15
表4 不同批次载药微囊中药物含量(n=3)Table 4 The content of decoquinate in alginate-chitosan microcapsules批次Lot No．含量(%)Contents 1 2 3平均含量(%Average contents 1)7．69 7．66 7．62 7．66 2 8．31 8．78 8．37 8．49 3 8．02 8．13 7．98 8．04
3 讨论与结论
3．1 破囊条件的选择
壳聚糖-海藻酸钠微囊内层囊膜是通过海藻酸钠与Ca2+结合形成稳定的络合物，而外层囊膜是海藻酸盐［Cam(C5 H7 O4 COO－)n］和壳聚糖(C6 H9O4
NH+3)n)通过正负电荷之间的静电力相互作用形成微囊。

当外部环境存在HCO－3时，存在以下反应。

在该反应中，随着CO2气体不断释放，反应持续向右进行，微胶囊的聚电解质复合膜逐渐解聚，暴露出内层的海藻酸钙凝胶珠。

此时较强的络合剂可以竞争性的络合海藻酸钙凝胶中的Ca2+，从而使内层的海藻酸钙凝胶珠溶解［5］。

本研究采用化学方法与机械方法相结合的破囊方法，结合超声破碎，使微囊完全破碎并释放出药物。

3．2 样品溶剂的选择
二氯甲烷和三氯甲烷提取效果比较研究发现，三氯甲烷与乙腈作为混合溶剂时，溶解不完全;二氯甲烷与甲醇作为混合溶剂时，久置后易产生少量沉淀;三氯甲烷与甲醇作为混合溶剂时，溶解良好，放置后无沉淀析出，故选择三氯甲烷与甲醇的混合溶液做样品溶剂。

3．3 流动相的选择
我国已对畜禽肉中癸氧喹酯残留量的检测方法制定了标准，该方法采用的流动相为乙腈∶甲醇∶硝酸钙溶液(77∶3∶20)。

而美国采用的是乙腈∶甲醇∶水
(65∶15∶20)并加入一定量的氯化镁［6］。

上述2种流动相用于癸氧喹酯微囊检测时均未能达到预期效果。

对比研究发现采用乙腈和0．1%甲酸水溶液作为流动相时分离效果较好，且成分相对简单。

当乙腈和0．1%甲酸水溶液比例分别为为73∶27、75∶25 和80∶20 时，主峰出峰时间分别为 9．2、8．3 和6．8 min。

色谱分析表明，出峰时间为8．3 min时药品峰的分离最好，故选择75∶25的比例作为最终流动相比例。

3．4 检测波长的选择
不同文献报告癸氧喹酯HPLC法检测选用的波长有所不同，主要有 3 个，分别是265［3］，267［4］和330［7］nm。

试验中用1μg/mL的标准品溶液在3种
不同的波长下进行检测，结果显示，330 nm波长时响应值低，主峰峰面积最小，仅相当于267 nm波长时的三分之一;265和267 nm检测波长时，响应值接近，但267 nm波长时的色谱图杂峰更少，故选择267 nm作为检测波长，在此色谱
条件下，色谱峰响应值高，分离效果好。

本研究建立的高效液相色谱法检测癸氧喹酯微囊中药物含量的方法，方法前处理简单，具有良好的专属性、精密度和准确度，色谱峰响应值高，分离度好，是较为理想的检测方法，可以应用到癸氧喹酯壳聚糖-海藻酸钠微囊中药物含量的检测。

参考文献:
【相关文献】
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