益肾汤对实验性IgA肾病模型小鼠肾组织转化生长因子β1表达的阻碍

益肾汤对实验性IgA肾病模型小鼠肾组织转化生长因子β1表达的阻碍
万启军，何永成，石成钢，洪国保，胡斌，栾韶东
【摘要】【目的】观看益肾汤对实验性IgA肾病（IgAN）模型小鼠肾组织转化生长因子β1（TGFβ1）表达的阻碍。

【方式】选用BALB/c小鼠，采纳口服牛血清白蛋白联合尾静脉注射葡萄球菌肠毒素B方式复制小鼠IgAN模型，抽样检测造模小鼠24h尿蛋白定量、肾组织过碘酸雪夫反映（PAS）染色及免疫荧光检查，确信造模成功后随机分为模型组，益肾汤高、低剂量组（剂量别离为0一、0
05g·kg-1·d-1），并设正常对照组；采纳荧光定量聚合酶链反映（FQ PCR）法检测各组小鼠肾组织TGFβ1mRNA表达，免疫组化法检测各组肾组织TGFβ1含量。

【结果】模型组肾组织TGFβ1mRNA表达及TGFβ1含量均显著升高（Ｐ＜００５）；益肾汤高、低剂量组肾组织TGFβ1mRNA表达及TGFβ1含量均显著降低（Ｐ＜００５）。

【结论】益肾汤医治IgAN的作用与抑制肾组织中TGFβ1的分泌及其mRNA表达有关。

【关键词】益肾汤/药理学；IgA肾病/中药疗法；肾/病理学；转化生长因子β；疾病模型，动物；小鼠
研究证明细胞因子在IgA肾病（IgAN）的发生进展进程中起重要
作用，其中，转化生长因子β1（TGFβ1）是公认的最重要的致纤维化因子［1］。

本研究观看了TGFβ1在实验性IgAN小鼠肾组织中表达的特点及中药方剂益肾汤对TGFβ1的阻碍，现报导如下。

1材料与方式
11益肾汤组方及制备益肾汤组成：黄芪15g、生地20g、牡丹皮10g、熟地15g、赤芍10g、当归10g、山药15g、茯苓15g、山茱萸15g、金樱子15g、枸杞子15g、白茅根30g、女贞子15g、旱莲草15g、仙鹤草20g。

依照“人—鼠用药剂量转换公式”计算，浓缩成高浓度（相当于成人剂量的2倍）及低浓度（相当于成人的每日用量）2种剂型，原液装瓶，高压消毒后密封保留，备用。

12实验动物BALB/c小鼠60只，鼠龄8～10周，体质量18～22g，雌性。

由中山大学实验动物中心提供，动物许可证：SCXK(粤)2004 0011，动物批号：NO0018045，粤监证字：2006A003。

13要紧试剂与仪器牛血清白蛋白（BSA）由深圳晶美生物提供，批号：RF101010；POINT GV20 (BAIHUI);POINT SP6 (SANYINJIAO)葡萄球菌肠毒素B（SEB）由中国军事医学科学院微生物流行病研究所提供；Trizol试剂（Invitrogen公司）；Primer express 20 软件（美国Applied Bio system Inc.）；PE 9600型PCR仪（美国Perkin
Elmer公司）；逆转录聚合酶链反映（RT PCR）试剂盒（德国QIAGEN 公司）；脱氧核糖核苷酸（dNTPs）（10mmol/L，华丽公司）；PE 7000型荧光定量仪（美国Perkin Elmer公司）；PCR buffer（美国ABI公司）；dNTPs （25mmol/L,Sigma公司）；荧光探针（10pmol/μL，上海生工）；Taq 酶（美国ABI公司）；德国KONTRON IBAS 25全自动图像分析系统。

14造模与分组按文献［2］方式复制小鼠IgAN模型：隔日灌服200mg/kgBSA，6周后按20mg/kg每日1次按期尾静脉注射BSA持续3d。

8周时按05mg/kg尾静脉注射SEB，每周1次，持续3周，观看至12周末。

造模第5周末，抽样检测造模小鼠24h尿蛋白定量、肾组织过碘酸雪夫反映（PAS）染色及免疫荧光检查，并与正常小鼠对照，确信IgAN模型成功后，随机分为模型组，益肾汤高、低剂量组，并设正常对照组；益肾汤高、低剂量别离以0一、005g·kg-1·d-1剂量灌胃给药，模型组、正常对照组灌服等容积蒸馏水，每日1次，均持续7周。

15荧光定量聚合酶链反映法（FQ PCR）检测各组小鼠肾组织TGFβ1mRNA的表达
151肾组织RNA的提取取肾组织块（约100mg）置匀浆器，加Trizol1mL，冷冻匀浆，转置于15mLEppendorf 管，加入氯仿0
2mL，盖紧盖子，使劲摇动15s，15℃～30℃孵育2～3min，4℃、12 000r/min离心15min；取上清液至另一个15mLEppendorf管，加与上清液等容积的异丙醇，15℃～30℃孵育样品10min，4℃、12 000r/min离心10min；弃上清液，体积分数75%乙醇洗涤沉淀1次，4℃、7 500r/min离心5min；弃乙醇，空气或真空干燥5～10min（不要完全干燥），加焦碳酸二乙酯水（DEPC）溶解RNA，-80℃保留备用。

假设长期保留，加入25倍容积乙醇，置-80℃保留。

152引物的设计和合成采纳ABI 3900台式高通量DNA合成仪合成。

引物和探针由中山大学达安基因诊断中心合成并纯化。

序列如下：TGFβ1：Forward Primer:5’CGGAATACAGGGCTTTCGATT 3’；Reverse Primer:5’GCTGATCCCGTTGATTTCCA3’；TaqMan Probe:5’FAM AGCGCTCACTGCTCTTGTGACA TAMRA3’。

GAPDH （内参照基因）：Forward Primer:5’TGTGTCCGTCGTG GATCTGA3’；Reverse Primer:5’TGCCTGCTT CACCACCTTCT3’；TaqMan Probe:5’FAM TGCCGCCTGGAGAAACCTG CC TAMRA3’。

153逆转录反映取4μLRNA模板做逆转录反映，反映体系如下：5倍逆转录buffer4μL［逆转录buffer成份为50mmol/L Tris HCl(pH80)、50mmol/L KCl、4mmol/L MgCl二、10mmol/L二硫苏糖醇（DTT）］，上游引物（10pmol/μL）04μL，下游引物（10pmol/μL）04μL，dNTPs（10mmol/L）05μL，MMLV反转录酶（200U/
μL）1μL，DEPC97μL，RNA模板4μL，整体积为20μL。

反映条件：37℃、1h，然后95℃、3min。

154荧光定量PCR反映以下反映均由PCR扩增仪扩增完成。

反映体积为50μL，反映体系：5倍定量PCR buffer 10μL，上游引物F（10pmol/μL）1μL，下游引物R（10pmol/μL）1μL，dNTPs 0 5μL，荧光探针1μL，Taq 酶15μL，互补DNA（cDNA）5μL，重蒸水（ddH2O）30μL［PCR buffer成份为10mmol/L Tris HCl(pH8
0)、50mmol/L KCl、2mmol/L MgCl2］。

反映条件：93℃、2min，93℃、45s， 55℃、45s，共40个循环。

16免疫组化法检测各组小鼠肾组织TGFβ1含量采纳免疫组化链霉亲和素—生物素过氧化物酶复合物（SABC）法。

取免疫组化的肾组织切片，置于显微镜下，计数10个肾小球，光学放大400倍，图像经全自动图像分析系统处置，应用阳性单位（positive unit，PU）的计算公式计算阳性单位的数值，以各组的PU值进行比较。

pPU=100%×(Ga-GA)/［(1-Aa)×Gmax］。

注：Ga为阳性反映的平均灰度级；GA 为整个视野的平均灰度；Aa为阳性反映的面积密度；Gmax为设定的灰度最高级（所用的是256），所有数据均由系统自动算出。

17统计学方式采纳SPSS 110统计软件进行统计分析。

2结果
21IgAN动物模型模型组小鼠尾静脉注射SEB后，死亡2只小鼠，其他小鼠均有不同程度的神态萎靡、皮毛蓬乱、反映性下降、食量减少等现象；而正常对照组小鼠活动度、反映性、进食量等均未见明显异样。

模型组抽样测定小鼠24h尿蛋白定量为（1172±442）mg/d，显著高于正常对照组的（554±146）mg/d（P ＜001）。

光镜见模型组小鼠肾小球体积轻度增大，系膜细胞和基质中、重度增生，部份肾小球囊腔粘连，肾小球毛细血管管腔挤压变窄，而正常对照组小鼠肾小球未见明显异样（图1）；免疫荧光检查结果显示模型组小鼠系膜区IgA+++，而正常对照组小鼠系膜区IgA-～±（图2）。

22肾组织TGFβ1含量的测定由表1可见，模型组小鼠肾组织TGFβ1含量显著高于正常对照组（P＜005）；益肾汤高、低剂量组小鼠肾组织TGFβ1含量均显著低于模型组（P＜005）；益肾汤高、低剂量组小鼠之间肾组织TGFβ1含量无显著性不同（P ＞005）。

各组小鼠肾组织TGFβ1表达见图3：正常对照组有少量TGFβ1表达；模型组TGFβ1表达明显增强；益肾汤高、低剂量组TGFβ1表达减弱。

表1各组小鼠肾组织TGFβ1 阳性表达单位值比较
23TGFβ1 mRNA表达结果TGFβ1 mRNA标准扩增曲线见图4；TGFβ1 mRNA标准曲线直线回归见图5；各样本TGFβ1荧
光扩增曲线见图6；各组肾组织TGFβ1 mRNA表达的不同见表2。

表2结果显示模型组小鼠肾组织TGFβ1 mRNA的表达显著高于正常对照组（P＜005）；益肾汤高、低剂量组小鼠肾组织TGFβ1 mRNA 的表达均显著低于模型组（P＜005）；两个益肾汤医治组小鼠之间肾组织TGFβ1 mRNA的表达无显著性不同（P＞005）。

图5为小鼠TGFβ1荧光定量标准回归曲线图，横坐标为起始拷贝数的对数，纵坐标为阈循环数nCt，相关系数r=0998 6。

线性关系良好，证明了nCt值进行定量的准确性。

通过荧光定量PCR的扩增得知样本的nCt 值，即可从该标准回归曲线上计算出该样本的起始拷贝数。

表2各组小鼠肾组织TGFβ1 mRNA定量表达比较
3讨论
IgAN是目前公认的发病率最高的原发性肾小球疾病，其要紧病理特点是：肾脏系膜细胞和系膜基质增生［3］。

IgAN系膜细胞和基质增生是多种因素综合作用的结果，多种细胞因子的作用与IgAN的发生和进展有关［4］。

TGFβ1作为一种多功能的细胞因子，通过细胞表面复杂的受体信号传导途径调控细胞的增殖、分化和凋亡［1］，专门在调控细胞外基质聚积(ECM)的进程中起中心调剂作用，其要紧机制有： (1)增加ECM的合成；(2)增加蛋白酶抑制因子的合成，减少ECM 的降解；(3)增强细胞表面与ECM结合的受体—整合素的表达。

最近几年来研究发觉TGFβ1在IgAN的发生、进展中均有十分重要的作用，
IgAN的血尿可能是因为链球菌感染后通过增加TGFβ1合成从而刺激IgA产生并最终致使IgAN的发生［5］；在IgAN的进展进程中肾内肾素血管紧张素系统（RAS）和通过TGFβ1介导的初期纤维化紧密相关［6］。

FQ PCR原理［7］：利用Taq酶对荧光双标记探针的切口平移效应，持续不断地检测反映体系中荧光信号的转变，当信号增强到某一阈值时，现在的循环阈值（nCt值）就被记录下来，该参数和PCR体系中起始DNA量的对数值之间有严格的线性关系，利用阳性梯度标准品的nCt值制成标准曲线，再依照样品的nCt值就能够够准确信出起始DNA的数量。

中医学以为IgAN属本虚标实之证，以肺、脾、肾三脏虚弱为本，外感、水湿、湿热、瘀血及湿浊为标［8］。

研究说明［9］，ECM聚积与中医的“血瘀”有紧密的联系，益气、化瘀法是中医医治肾小球疾病的经常使用治法，有确切的疗效。

益肾汤是在古代名方六味地黄丸（《小儿药证直诀》）基础上，结合临床用药体会加减化裁而成。

方中熟地甘柔补血、滋肾填精，当归补血活血；山茱萸、枸杞子、女贞子滋养肝肾固肾气，黄芪补气升阳，山药健脾益胃以助运化，茯苓渗利脾湿，牡丹皮凉泻肝火，生地、赤芍、白茅根清热凉血，金樱子固精，旱莲草滋阴，仙鹤草收敛。

诸药合用，具有滋阴补肾固精、清热凉血活血之功效，主治肝肾阴虚之证。

益肾汤组方中，多味中药均有利气、活血、化瘀之功效［10-11］，因此，益肾汤医治IgAN符合中医学及现代医学对IgAN病因、病理、病机规律的熟悉。

已有临床验证益肾汤具有减少IgAN患者的蛋白尿、稳固患者肾功能的作用［12］。

本实验结果显示，IgAN模型小鼠肾组织TGFβ1的分泌
及其mRNA表达显著升高，提示TGFβ1参与了IgAN的发病进程，对IgAN模型所见的ECM增加有重要意义；益肾汤医治组小鼠肾组织中TGFβ1的分泌及其mRNA表达较IgAN模型组显著减少，显示益肾汤可抑制IgAN肾组织中TGFβ1的表达、减少ECM的合成，进而延缓IgAN肾小球硬化的进展。

【参考文献】
［1］冯湛岚.TGFβ1与肾脏疾病的研究新进展［J］.国外医学：泌尿系统分册，1999，19(6):280.
［2］刘志红，黎磊石，李莉.葡萄球菌肠毒素诱发的IgA肾病模型［J］.中华肾脏病杂志，1989，5 (1)：6.
［3］陈香美，谢院生.重视延缓IgA肾病进展的基础和临床研究［J］.中华肾脏病杂志，2004,4(3):235.
［4］Yano N,Endoh M,Nomoto Y,et characterization of cytokine expression in patients with IgA nephropathy［J］.J Clin Immunol Related,1997,17(5):396.
［5］Nishikawa Y，Shibata R，Ozono Y，et a1．Streptococcal M protein enhances TGF beta production and increase surface IgA
positive B cells in vitro in IgA nephropathy［J］.Nephrol Dial Transplant，2000，15(6)：772.
［6］Del Prete D，Gambaro G，Lupo A，et a1．Precocious activation of genes of the rennin angiotensin system and the fibrogenic cascade in IgA glomerulonephritis［J］．Kidney Int，2003，64(1)：149.
［7］Holland P M,Abramson R D,Watson R,et of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5’3’exonuclease activity of thermos aquaticus DNA polymerase ［J］.Proc Natl Acad Sci USA,1991,88(16):7276.
［8］刘宏伟，庞俊娟．中医药医治lgA肾病的临床探析［J］．辽宁中医杂志，1998，25(4)：158.
［9］陈香美，陈以平，李平，等.1016例IgA肾病患者中医证候的多中心流行病学调查及相关因素分析［J］.中国中西医结合杂志，2006，3（26）：197.
［10］Yin X X，Zhang Y D，Wu H W，et a1．Protective effects of astragalus saponin I on early stage of diabetic nephropathy
in rats［J］．J Pharmacol Sci，2004，95(2)：256.
［11］Ang N，Isbel N M，Nikolkrpaterson D J，et a1．Local macrophage proliferation in human glomerulonephritis［J］．Kidney Int，1998，54：143.
［12］赵文景，张胜容，孙明霞.益肾汤配合西药医治IgA肾病的临床观看［J］.北京中医，2005，2（4）：197.。