猪金黄色葡萄球菌的分离培养和药敏试验

猪金黄色葡萄球菌的分离培养和药敏试验
龚岳
【期刊名称】《养猪》
【年(卷),期】2017(000)006
【总页数】3页(P108-110)
【作者】龚岳
【作者单位】滨海新区塘沽动物卫生监督所,天津滨海新区 300454
【正文语种】中文
【中图分类】S858.282.61
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为革兰氏阳性球形细菌，显微镜下排列成葡萄串状，无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜，是常见的引起食物中毒的致病菌，常见于皮肤表面及上呼吸道黏膜。

金黄色葡萄球菌对营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37℃，最适生长pH 7.4。

平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径
1~2 mm。

血平板菌落周围形成透明的溶血环。

金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10%~15%氯化钠（NaCl）肉汤中生长。

可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气，甲基红反应阳性，VP反应弱阳性[1]。

许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。

在干燥环境中可存活数月；在空气中存在，但不繁殖。

耐热性强，加热70℃1 h或80℃30 min不被杀死；耐低温，在冷冻食
品中不易死亡；耐高渗，在含有50%~66%蔗糖或15%以上食盐食品中才可被抑
制。

日常生活中，人之间的接触或打喷嚏，被猫、狗咬伤等，尤其是猪群大规模饲养中，如果不注意人和易感动物的交叉感染，都可感染金黄色葡萄球菌。

此外，耐药的金黄色葡萄球菌可能通过食物、水源、毛发和其他接触方式传递给人，对公共卫生造成了严重威胁[2]。

本试验采集患病猪只患处脓汁、渗出液、伤口分泌物、血液、尿液、粪便等不同样品，分离培养和鉴定金黄色葡萄球菌，并进行生化试验和药敏试验，研究金黄色葡萄球菌对先锋V、庆大霉素、氯霉素、四环素、青霉素、链霉素和红霉素的耐药性。

细菌分离培养与药敏试验于2016年9月中旬至9月底在天津农学院动物医学实
验室进行。

1.2.1 培养皿的准备
（1）将30个培养皿清洗干净，并用蒸馏水冲洗、晾干。

（2）将培养皿用培养皿灭菌布袋包好，置于160℃电热恒温鼓风干燥箱中2 h。

1.2.2 培养基所需器皿和试剂
（1）器皿：量筒（100 mL）、烧杯（1 000 mL和100 mL各 1个）、漏斗、三角烧瓶（100 mL）、试管、玻璃棒、刻度吸管（1 mL和10 mL各1个）、pH
试纸、纱布、脱脂棉、天平、电炉、试管塞、包装纸、扎绳、洗耳球等。

（2）试剂：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钾、琼脂条或粉、0.1 mol/L和
1 mol/L的氢氧化钠水溶液、0.1 mol/L和1 mol/L的盐酸溶液、蒸馏水、家兔血液。

1.3.1 普通肉汤培养基的制作
（1）按以下剂量称取各种试剂置于烧杯中：牛肉膏 5 g，蛋白胨 10 g，氯化钠 5 g，磷酸氢二钾 1 g，蒸馏水1 000 mL。

（2）将上述成分混合加热溶解后，以0.1 mol/L氢氧化钠水溶液调整至pH
7.4~7.6。

（3）将pH测定后的肉汤培养基用滤纸过滤。

（4）将过滤好的肉汤分装试管，每管约5 mL，塞上棉塞，用包装纸扎好待灭菌。

（5）将培养基置高压蒸汽锅内，121℃灭菌15~30 min。

1.3.2 普通琼脂培养基的制作
（1）将称好的琼脂加到普通肉汤内，加热煮沸，待琼脂完全融化后，将pH调至7.4~7.6，再加热煮沸20 min。

（2）用蒸馏水湿润夹有薄层脱脂棉的纱布过滤，边过滤边分装试管，每管约4~5 mL（约3指高），试管分装完毕塞好棉塞，待灭菌。

（3）将培养基置高压蒸汽锅内，121℃灭菌15~30 min，趁热将试管口一端搁在玻璃棒上，使之有一定坡度，凝固后即成为普通琼脂斜面，也可直立，凝固后即成为高层琼脂。

（4）剩余部分的琼脂用手指感触，若将琼脂瓶紧握手中觉得烫手、但仍能持握时，即为倾倒平皿合适温度（50~60℃）。

每只灭菌培养皿倒入10~15 mL，将培养
皿盖盖上，并将培养皿于桌面轻轻回转，使培养基平铺于培养皿底，即成普通琼脂平板。

（5）培养基中的某种成分，如血清、糖类、尿素、氨基酸等在高温下易于分解、变性，故应过滤除菌，再按规定的量加入到培养基中。

1.3.3 鲜血琼脂培养基的制作
（1）将灭菌的普通琼脂培养基加热融化，待冷却至50℃左右，加入无菌的家兔
鲜血5%（即每100 mL普通琼脂加鲜血5~6 mL）混合后，分装灭菌试管立即摆成斜面或倾注于灭菌平皿。

待凝固后，置37℃培养24 h，无菌检验合格方可应用。

（2）无菌血液是用无菌操作方法采自健康动物。

将家兔血液加到盛有5%灭菌枸
橼酸钠的100 mL三角瓶内，马上封住瓶口快速而柔和地摇晃直到看见上层出现
白色纤维蛋白，除掉纤维蛋白后置7℃冰箱中待用。

2016年7—9月，分别采集天津市武清区某生猪养殖场患病猪只病料，其中伤口
分泌物22份、脓汁8份、粪便5份、渗出液7份，共42份。

把取得的42份病
料分别置于无菌生理盐水中，充分混匀，制成稀释液，保存在5℃冰箱中待用。

1.5.1 增菌培养将采集后配制的稀释液2 mL接
入7.5%NaCl肉汤中，37℃培养24 h。

1.5.2 划线分离培养
（1）左手持皿，用左手的拇指、食指及中指将皿盖揭开呈20°左右的角度。

（2）右手持接种环，从采集的细菌肉汤中取少许涂布于培养基边缘，然后将接种环上多余的材料在火焰中燃烧，待接种环冷却后，再与所涂的地方轻轻接触，开始划线。

（3）划线前先将接种环稍稍弯曲，这样易和平皿内琼脂面平行，不致划破培养基。

（4）划线中不宜过多的重复旧线，以免形成菌苔。

（5）接种完毕，在平皿底部作好菌名、日期和接种者等标记，平皿倒扣，置于37℃培养24~48 h。

取营养琼脂上的菌落置于洁净试管内或洁净玻片上，滴加3%H2O2溶液数滴，观察结果，如1 min内有大量气泡产生为阳性，不产生或气泡量少为阴性。

1.7.1 菌液制备取培养基上新鲜菌落制成麦氏比浊管3号及0.5号菌液各1管约1.5 mL，另取已制备好的3号菌液4滴，加入2滴甲苯用于β-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）。

1.7.2 试验操作
（1）碱磷酶、尿素酶、吡咯烷酮芳胺酶（PYR试验）及木糖试验均加相当于3号麦氏比浊管浓度菌液各4滴。

（2）ONPG加相当于3号麦氏比浊管浓度菌液4滴及2滴甲苯。

（3）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验葡萄糖管用液体石蜡加封。

1.7.3 培养条件放在35℃恒温箱中，6 h后观察结果。

1.7.4 判定方法
（1）碱磷酶试验管内加两滴1 mol/L NaOH，5 min变为黄色为阳性，否则为阴性。

（2）ONPG试验变成黄色为阳性，否则为阴性。

（3）尿素酶试验变为红色
为阳性，否则为阴性。

（4）PYR试验管内加入一滴PYR显色剂5 min呈现红色
为阳性，否则为阴性。

（5）木糖试验变成黄色为阳性，否则为阴性。

（6）无氧条件下发酵葡萄糖为葡萄糖球菌（发酵型），不发酵为微球菌（氧化型）。

1.8.1 材料准备菌种：金黄色葡萄球菌。

药敏试纸：先锋V、青霉素、链霉素、庆大霉素、氯霉素、红霉素、四环素的药敏纸片。

器材：酒精灯、小镊子、普通琼脂平板。

1.8.2 操作方法取金黄色葡萄球菌种，用灭菌接种环致密划线于琼脂平板表面（可重复来回划线），或用“十”字划线法。

用无菌镊子将各种抗菌药物圆片分别贴于培养基表面，各片距离要相等。

在皿底标记记号1~30，37℃培养24 h观
察[3]。

平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，边缘整齐、表面光滑、湿润，直径一般为1～2 mm。

平板上菌落呈金黄色，有时也呈白色，大而凸起，圆形、不透明、表面光滑，周围有透明的β溶血环。

菌株革兰氏染色阳性，呈葡萄串状排列，无芽孢、荚膜。

玻片上滴加双氧水后产生大量气泡，表明分离菌为触酶阳性。

分离菌在碱磷酶试验中呈阳性，在ONPG试验中呈阴性，在尿素酶试验中呈阳性，在PYR试验中呈阴性，在木糖试验中呈阴性，在O/F葡萄糖试验中呈阳性（表1）[4]。

由以上试验结果可知分离菌为金黄色葡萄球菌。

由表2可知，金黄色葡萄球菌对先锋V敏感性最高达93.3%；其次是庆大霉素和
氯霉素，敏感率分别为73.3%、66.7%；而对四环素、青霉素、链霉素、红霉素
敏感率相对较低，分别为40%、30%、20%、6.7%。

金黄色葡萄球菌对青霉素、链霉素、红霉素具有一定的耐药性，其耐药率分别为33.3%、36.7%、60%。

葡萄球菌在自然界中分布广泛，绝大多数不致病，仅少数引起人和动物的化脓性感染。

其致病性随细菌侵入途径、菌量、毒力及机体免疫力不同而不同。

由于抗生素的广泛使用，耐药菌株逐年增加，目前葡萄球菌属中引起致病性的金黄色葡萄菌对青霉素的耐药率已高达90%[6]，给临床治疗造成了很大的困难。

通过本试验采集的病料来看，猪只感染发病一部分来自于葡萄球菌感染，而主要致病菌为金黄色葡萄球菌。

同时，本试验对从42份病料中获得的30株金黄色葡萄
球菌的药敏试验结果现示，金黄色葡萄球菌对先锋V、庆大霉素、氯霉素有较高的敏感性，虽然其对青霉素、链霉素、红霉素也有较低的高敏感性，但耐药性更高。

本试验对从42份病料中获得的30株金黄色葡萄球菌进行药敏试验，结果显示，
金黄色葡萄球菌对先锋V的敏感性最高，高达93.3%；其次是庆大霉素和氯霉素，敏感率分别为73.3%、66.7%；而对四环素、青霉素、链霉素、红霉素敏感率相
对较低，分别为40%、30%、20%、6.7%。

金黄色葡萄球菌对青霉素、链霉素、红霉素具有一定的耐药性，其耐药率分别为33.3%、36.7%、60%。

因此，患病
猪只被金黄色葡萄球菌感染后，建议采用先锋V、庆大霉素抗生素进行治疗。

同时，建议对常用抗生素治疗效果欠佳的皮肤、伤口等感染应做细菌培养和药物敏感试验，以选取敏感药物，避免抗生素的滥用，减少细菌耐药性的发生。

但要注意到是药物的用量和使用时间，不宜长期固定使用一种药物，应该经常更换药物品种或适时停用。

最后要定期进行疫病检查，定期及时消毒猪舍和饲养场，这对隐性感染和带菌排菌
的猪来说十分重要。

同时做好患病猪的处理工作，对一般性传染病，应及时隔离，积极治疗；对不宜治愈的猪只最好采取扑杀办法，尸体深埋或焚烧，以彻底消灭传染源。

一项最新研究发现，使用消毒剂会增大罹患肺病的风险。

慢阻肺通常与吸烟相关，但经常吸入漂白剂或消毒液中所含强刺激性化合物也会导致患病风险增加。

研究称，频繁使用漂白剂、消毒液，可使慢阻肺风险提升32%。

该研究由法国国家卫生和医学研究所组织开展。

研究人员以5.5万名女护士为研究对象，了解她们接触各种消毒剂的数量并研究这种接触与慢阻肺之间的关联。

研究始于2009年，当时参与的护士都在岗，且都没得过慢阻肺。

8年后，其中663名护士被确诊患上慢阻肺。

研究人员评估分析了这些护士接触漂白剂、消毒液的情况，并剔除了吸烟、年龄、体质和种族等可能影响研究结果的诸多因素。

结果发现，医院中消毒、清洁常用的漂白剂、双氧水、酒精、季铵化合物等都与慢阻肺有关联，罹患风险增加24%~32%不等。

法国国家卫生和医学研究所奥丽安娜·杜马斯说：“虽然近期有研究显示清洁工患
慢阻肺的风险较高，但接触消毒剂的潜在负面影响未受到足够重视。

我们还需研究特定职业终生接触消毒剂和罹患慢阻肺的关联，并搞清楚任一特定消毒剂的具体危害。

”
【相关文献】
[1] 王江桥，罗君，蔡珠，等.金黄色葡萄球菌感染的特征及其耐药性[J].实用预防医学，2007，14（4）：990-991.
[2] 朱以军，徐瑞龙，单小云，等.医院感染葡萄球菌属的分布特点与耐药性[J].中华医院感染学杂志，2007，17（5）：599-601.
[3] 王悦，杨敬芳，张鲁涛，等.318株金黄色葡萄球菌的临床科室分布、耐药性及其感染的预防[J].河北医科大学学报，2008，29（6）：869-837.
[4] 陈林珍，李晓穗，李瑞莹.351株葡萄球菌的鉴定及药敏试验[J].药物不良反应杂志，2005（5）：330-332.
[5] 李素梅.131株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药性分析[J].广东医学院学报，2007，25（4）：439-440.
[6] 方玲，陈江华，顾向明，等.临床常见病原菌分布及耐药性分析[J].检验医学与临床，2008，5（4）：210-211.。