Snapshot技术平台(中文)

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Snapshot技术平台
SnaPshot技术平台是Applied Biosystems,ABI公司推出了专为检测SNP 设计的分析软
件和试剂盒可对多个SNP 位点同时进行基因分型,也被称为minisequencing 。

该方
一.??? SnaPshot工作原理
应用SNaPshot 进行定点的序列分析,其基本原理遵循了DNA 直接测序中的双脱氧终止法,所不同的是PCR 反应中只有不同荧光标记的ddNTP。

由于每个
SNP 位点的引物3′端都紧靠SNP点,因此每一种引物在聚合酶作用下,根据模板的的序列,只延伸一个核苷酸。

然后用先进的荧光检测系统,检测延伸的那个核苷酸的种类。

1．多重SNaPshot反应的工作原理：在一个SNaPshot反应体系中，针对每个待测SNP 位点在其上游或下游设计一条单向的寡核苷酸引物（正向引物或反向引物），
ddNTP
可在
4-6
4
, 是
图
2
工作的进度取决于多重PCR和EXTENSION的条件优化过程。

还有测序仪的通量也是很重要的，3730每天可以做16次96道电泳，如果每次出4个位点，那每天的通量就是6000个GENOTYPING，是中等通量的检测。

二.??? SnaPshot工作流程
1．引物的设计
SNAPSHOT可以检测多重的SNP，我们一般选择4－5个位点做一个组合。

现对这些目的SNP进行引物的设计。

每个SNP设计3条引物，其中2条是目的片段的扩增，长度在200－500bp左右，Tm值在60度左右。

第3条的引物的是延伸ddNTP,设计在SNP位点的上游或者是反向的下游。

引物设计注意事项：
1．同一反应管中，不同位点的引物长度必须不同，最好能相差4-6个碱基。

2．引物与模板互补部分（有效引物）的Tm值至少要50 C。

如分子量为7003，则加入660000/7003=94.2ul 做试验前将一组的引物加DDH2O稀释成10mM.
反应体系：
用量
10×Buffer (15Mm Mg2＋) 1 ?L
Primer (10Mm) 0.4 ?L
dNTP(10Mm) 0.3 ?L
HotStar (5u/ul) 0.1 ?L
DNA 1 ?L
Mg2＋(25Mm) 0.52 ?L
ddH2O 6.68 ?L
Total Volume 10 ?L
多重PCR反应采用Touch－down的PCR反应程序:
95 ℃15 min;
94 ℃40 s, 63 ℃1 min 每个循环下降0.5 ℃,72 ℃1.5 min,1 5个循环;
94
72
PCR
多重
3．
多色。

质粒
, ExoI
4．SNaPshot PCR
混合模板：如果以PCR产物作为SNaPshot PCR的模板，在纯化好后，每种各取2 ?L，混合。

混合SNaPshot的PCR引物：每种引物在反应体系中的终浓度分别为0.2 ?M。

混合SNaPshot的PCR引物：每种引物在反应体系中的终浓度分别为0.2 ?M。

(每个SNP引物加
1-2ul到500ulDDH2O中)
SNaPshot PCR：
用量(?L / Sample)标准品(?L)
Reaction Mix 0.5 5
Pooled PCR Products 2 2
Pooled Primers 1.2 1
dH2O 1.3 2
总体积 5 ?L 10 ?L
PCR循环条件为：
96 ?C 10 sec ? (96 ?C 10 sec ? 50 ?C(53?C)5 sec ? 60 ?C 30 sec) ? 25循环? 60 ?C 30
sec ? 4 ?C
5．SNaPshot PCR产物的纯化
在5 ?L上述SNaPshot PCR产物中加入0.5USAP或者1 U CIP，震荡混匀，37 ?C 保温1 hr，75 ?C 保温15 min以灭活酶，4 ?C可保存24 hr或-20 ?C长期保存。

15 20 25
35 50 62 80
110 120
三SnaPshot技术平台的优点
1．引物和探针合成周期短，国内一周之内可以合成完毕。

2．可以做多重的SNP检测，降低了成本。

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4．
5．。