氨肽酶的发酵、提取和活性测定
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氨肽酶的发酵、提取和活性测定 的发酵、 的发酵
生化系08生本班刘晶鑫
背景知识
氨肽酶是一种外肽酶,作用范围都为广谱,根 据最易反应的底物不同可分为亮氨酸氨肽 酶、缬氨酸氨肽酶、丙氨酸氨肽酶、苯丙 氨酸氨肽酶、脯氨酸氨肽酶等, 它们可切除 苦味肽氨端的疏水氨基酸,从而脱除苦味。 可广泛用于肉制品加工,乳品业等,减少苦味, 增加游离氨基酸,提高食品营养价值;氨肽酶 还可用作蛋白序列测定的分子工具及重组 蛋白或融合产物的固化剂等。
酶活力测定(LNA 法)
加入一定量Tris-HCl 缓冲溶液和L2亮氨酸2 对硝基苯胺,再加入稀释一定倍数的酶液,反 应一定时间后,405 nm 比色测定酶活。酶活 ,405 力定义:50 ℃,每分钟分解L2亮氨酸2对硝基 苯胺产生1µmol 的对硝基苯胺所需酶量即 为1 个酶活单位。
氨肽酶的纯化结果
试剂ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ仪器
枯草芽孢杆菌Zj016 ,本实验室筛选保藏。 Sephadex G275 , 购自 AmershamBioscience 公司;丙烯酰胺、甲 叉双丙烯酰胺、考马斯亮蓝R2250 ,购自 Fluka 公司;其余均为国产分析纯试剂
枯草杆菌发酵液的制备
发酵培养基配方： 发酵培养基配方：可溶性淀粉15 g/ L , 蛋白胨10 g/ L ,
乙醇分级沉淀
(1)向收集的上清液中加入－２０℃乙醇，使乙醇终浓度为２０％进行第 一次醇沉，４℃以10000ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ后，弃沉淀，收集上 清液； (2)往第一次醇沉后的上清液中加入－２０℃乙醇，使乙醇终浓度为４０ ％进行醇沉，４℃以１００００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ后，弃上清， 取沉淀； (3)沉淀加入少量ｐＨ８.５含０.１ｍｍｏｌ／ＬＣｏＣｌ２的三羟甲基氨 基甲烷Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液溶解，４℃以10000ｒｐｍ离心１０ ｍｉｎ后，弃沉淀，收集上清液，即为氨肽酶溶液。
Phenyl2sepharose6FF 疏水色谱
Phenyl2sepharose6FF 层析柱(40 cm ×115 cm) , 以含0.8 mol/ L 的(NH4) 2SO4 的pH8.5 ,25 mmol/ LTris-HCl 缓冲液平衡柱子,上样量2.5 mL ,分别以 含0.8 mol/ L , 0.6 mol/ L , 0.4 mol/ L , 0.2 mol/ L (NH4) 2SO4 的pH 8.5 ,25 mmol/LTris-HCl 缓冲液 进行梯度洗脱,每个梯度均以LNA 法检测酶活,合 并具有酶活的洗脱液,用pH 8.5 ,10 mmol/ L TrisHCl缓冲液(含0.1 mmol/ L 的Co2 + ) 透析过夜,冷 冻干燥。
收集发酵液： 收集发酵液：将发酵液４℃10000ｒｐｍ离心１０ｍｉ
ｎ后，弃沉淀，收集上清液；
氨肽酶的分离纯化步骤
粗酶液→乙醇分级沉淀(370c15 %～60 %) →酶沉淀,缓冲液溶解,15 000 r/ min 冷冻离 心10 min ,去除沉淀→ Sephadex G275 凝 10 , → 胶过滤→ Phenyl2sepharose6FF 疏水色谱 →SDS - PAGE 鉴定。
实验目的 通过以氨肽酶 的发酵生产为实例， 氨肽酶的发酵生产为实例 通过以 氨肽酶 的发酵生产为实例 ， 学习 和掌握酶的液体发酵和乙醇分级沉淀 (370c15 %～60 %) 、SephadexG275 凝 胶过滤、Phenyl2sepharose6FF 疏水色 谱三步分离提取纯化的基本原理和过程 ， 提取纯化的基本原理和过程， 提取纯化的基本原理和过程 掌握氨肽酶 分析方法、 氨肽酶分析方法 掌握 氨肽酶 分析方法 、 发酵和提取的评 价标准。 价标准。
牛肉膏2g/L , 酪蛋白5g/ L , K2HPO4 ·12H2O 0.16 g/ L , K2HPO4 2.68 g/ L , NaCl 1 g/ L , MgSO4 ·7H2O 0.1g/ L 。
发酵条件： 发酵条件：接种量8%，初始pH7.5～8，35～40℃，
200～400ｒｐｍ，培养15～16h；
Sephadex G275 凝胶过滤
Sephadex G275 层析柱( 60 cm ×111cm) , pH8.5 ,50 mmol/ L Tris-HCl 缓冲液(含0.1 mmol/ L 的Co2 + ) 平衡柱子,相同缓冲液进 Co , 行洗脱,上样量0.5mL ,流速为0.4 mL/ min , 每管收集1.2 mL ,LNA 法检测酶活,合并具 酶活的部分,冷冻干燥。
图1
Sephadex G275 凝胶过滤
1 - 分子量标准; 2 - 乙醇分级沉淀; 3 - Sephadex G275 ; 4 - Phenyl2sepharose6FF 疏水色 谱 图3 纯化电泳图
参考文献
1 汪家政,范 明. 蛋白质技术手册[M] 1 北 京:科学出版社,2001 2 颜思旭,蔡红玉. 酶催化动力学原理与方 法[M]1 厦门:厦门大学出版社,1987 3 田亚平 须瑛敏.一种枯草芽孢杆菌氨肽 一种枯草芽孢杆菌氨肽 酶的纯化及酶学性质[M] 1无锡：江南大学 酶的纯化及酶学性质 出版社, 2006
枯草芽孢杆菌介绍
一、形态特征：枯草芽孢杆菌细胞杆状， 形态特征： 形态特征 直径0.6µm～1.0µm，长1.5µm～2.0µm， 芽孢中生，椭圆，孢囊不膨大，革兰氏反 应阳性。在锰营养琼脂平板上37℃培养36h 形成的菌落为圆形，直径3.0mm～10.0mm， 淡黄色，中间色深，表面平整不光滑，无 光泽，边缘不整齐。
生化系08生本班刘晶鑫
背景知识
氨肽酶是一种外肽酶,作用范围都为广谱,根 据最易反应的底物不同可分为亮氨酸氨肽 酶、缬氨酸氨肽酶、丙氨酸氨肽酶、苯丙 氨酸氨肽酶、脯氨酸氨肽酶等, 它们可切除 苦味肽氨端的疏水氨基酸,从而脱除苦味。 可广泛用于肉制品加工,乳品业等,减少苦味, 增加游离氨基酸,提高食品营养价值;氨肽酶 还可用作蛋白序列测定的分子工具及重组 蛋白或融合产物的固化剂等。
酶活力测定(LNA 法)
加入一定量Tris-HCl 缓冲溶液和L2亮氨酸2 对硝基苯胺,再加入稀释一定倍数的酶液,反 应一定时间后,405 nm 比色测定酶活。酶活 ,405 力定义:50 ℃,每分钟分解L2亮氨酸2对硝基 苯胺产生1µmol 的对硝基苯胺所需酶量即 为1 个酶活单位。
氨肽酶的纯化结果
试剂ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ仪器
枯草芽孢杆菌Zj016 ,本实验室筛选保藏。 Sephadex G275 , 购自 AmershamBioscience 公司;丙烯酰胺、甲 叉双丙烯酰胺、考马斯亮蓝R2250 ,购自 Fluka 公司;其余均为国产分析纯试剂
枯草杆菌发酵液的制备
发酵培养基配方： 发酵培养基配方：可溶性淀粉15 g/ L , 蛋白胨10 g/ L ,
乙醇分级沉淀
(1)向收集的上清液中加入－２０℃乙醇，使乙醇终浓度为２０％进行第 一次醇沉，４℃以10000ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ后，弃沉淀，收集上 清液； (2)往第一次醇沉后的上清液中加入－２０℃乙醇，使乙醇终浓度为４０ ％进行醇沉，４℃以１００００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ后，弃上清， 取沉淀； (3)沉淀加入少量ｐＨ８.５含０.１ｍｍｏｌ／ＬＣｏＣｌ２的三羟甲基氨 基甲烷Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液溶解，４℃以10000ｒｐｍ离心１０ ｍｉｎ后，弃沉淀，收集上清液，即为氨肽酶溶液。
Phenyl2sepharose6FF 疏水色谱
Phenyl2sepharose6FF 层析柱(40 cm ×115 cm) , 以含0.8 mol/ L 的(NH4) 2SO4 的pH8.5 ,25 mmol/ LTris-HCl 缓冲液平衡柱子,上样量2.5 mL ,分别以 含0.8 mol/ L , 0.6 mol/ L , 0.4 mol/ L , 0.2 mol/ L (NH4) 2SO4 的pH 8.5 ,25 mmol/LTris-HCl 缓冲液 进行梯度洗脱,每个梯度均以LNA 法检测酶活,合 并具有酶活的洗脱液,用pH 8.5 ,10 mmol/ L TrisHCl缓冲液(含0.1 mmol/ L 的Co2 + ) 透析过夜,冷 冻干燥。
收集发酵液： 收集发酵液：将发酵液４℃10000ｒｐｍ离心１０ｍｉ
ｎ后，弃沉淀，收集上清液；
氨肽酶的分离纯化步骤
粗酶液→乙醇分级沉淀(370c15 %～60 %) →酶沉淀,缓冲液溶解,15 000 r/ min 冷冻离 心10 min ,去除沉淀→ Sephadex G275 凝 10 , → 胶过滤→ Phenyl2sepharose6FF 疏水色谱 →SDS - PAGE 鉴定。
实验目的 通过以氨肽酶 的发酵生产为实例， 氨肽酶的发酵生产为实例 通过以 氨肽酶 的发酵生产为实例 ， 学习 和掌握酶的液体发酵和乙醇分级沉淀 (370c15 %～60 %) 、SephadexG275 凝 胶过滤、Phenyl2sepharose6FF 疏水色 谱三步分离提取纯化的基本原理和过程 ， 提取纯化的基本原理和过程， 提取纯化的基本原理和过程 掌握氨肽酶 分析方法、 氨肽酶分析方法 掌握 氨肽酶 分析方法 、 发酵和提取的评 价标准。 价标准。
牛肉膏2g/L , 酪蛋白5g/ L , K2HPO4 ·12H2O 0.16 g/ L , K2HPO4 2.68 g/ L , NaCl 1 g/ L , MgSO4 ·7H2O 0.1g/ L 。
发酵条件： 发酵条件：接种量8%，初始pH7.5～8，35～40℃，
200～400ｒｐｍ，培养15～16h；
Sephadex G275 凝胶过滤
Sephadex G275 层析柱( 60 cm ×111cm) , pH8.5 ,50 mmol/ L Tris-HCl 缓冲液(含0.1 mmol/ L 的Co2 + ) 平衡柱子,相同缓冲液进 Co , 行洗脱,上样量0.5mL ,流速为0.4 mL/ min , 每管收集1.2 mL ,LNA 法检测酶活,合并具 酶活的部分,冷冻干燥。
图1
Sephadex G275 凝胶过滤
1 - 分子量标准; 2 - 乙醇分级沉淀; 3 - Sephadex G275 ; 4 - Phenyl2sepharose6FF 疏水色 谱 图3 纯化电泳图
参考文献
1 汪家政,范 明. 蛋白质技术手册[M] 1 北 京:科学出版社,2001 2 颜思旭,蔡红玉. 酶催化动力学原理与方 法[M]1 厦门:厦门大学出版社,1987 3 田亚平 须瑛敏.一种枯草芽孢杆菌氨肽 一种枯草芽孢杆菌氨肽 酶的纯化及酶学性质[M] 1无锡：江南大学 酶的纯化及酶学性质 出版社, 2006
枯草芽孢杆菌介绍
一、形态特征：枯草芽孢杆菌细胞杆状， 形态特征： 形态特征 直径0.6µm～1.0µm，长1.5µm～2.0µm， 芽孢中生，椭圆，孢囊不膨大，革兰氏反 应阳性。在锰营养琼脂平板上37℃培养36h 形成的菌落为圆形，直径3.0mm～10.0mm， 淡黄色，中间色深，表面平整不光滑，无 光泽，边缘不整齐。