卧龙自然保护区落叶阔叶林土壤微生物分布规律及功能菌的筛选

卧龙自然保护区落叶阔叶林土壤微生物分布规律及功能菌的筛
选
韩梅;焦如珍;董玉红
【摘要】利用平板分离培养技术对卧龙自然保护区落叶阔叶天然林植被下不同层次土壤微生物区系进行研究.结果表明:各样地不同土层细菌、真菌及放线菌数量均表现为FH层＞A层＞B层＞C层,而各样地不同菌类的数量均表现为细菌＞放线菌数＞真菌.利用选择性培养基羧甲基纤维素钠筛选纤维素分解菌28株;利用苯胺蓝平板脱色法及愈创木酚变色圈法筛选具有木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶的细菌2株、真菌25种、放线菌3种,具有漆酶的真菌5种;在无机磷Ca3(PO4)2为唯一磷源的培养基上筛选出97株溶磷菌;在无氮培养基上筛选出固氮菌2株;溶磷菌无论种类还是数量均比纤维素分解菌、木质素分解菌及固氮菌多.
【期刊名称】《林业科学》
【年(卷),期】2013(049)010
【总页数】5页(P113-117)
【关键词】落叶阔叶林;微生物区系;功能菌筛选
【作者】韩梅;焦如珍;董玉红
【作者单位】中国林业科学研究院林业研究所北京100091;中国林业科学研究院林业研究所北京100091;中国林业科学研究院林业研究所北京100091
【正文语种】中文
【中图分类】S718.8
森林是陆地生态系统的主体，是人类和多种生物赖以生存和发展的基础。

第七次全国森林资源清查结果(贾治邦，2009)显示:截至2008年，我国森林面积为1.95亿hm2，其中天然林面积 1.20亿hm2，占有林地面积的65.99%;天然林中98%为
天然次生林，在我国森林中占有很重要的地位。

我国人均森林面积0.145 hm2，
不足世界人均占有量的四分之一。

长江上游防护林50年来已经损毁过半(任海等，2002;贾志邦，2009)，严重影响我国长江流域的生态环境。

四川卧龙自然保护区
是长江、岷江上游重要的天然次生林分布地，被誉为“生物基因库”、“天然动植物园”，物种丰富，森林植被带垂直分布明显，森林土壤也呈明显的垂直分布。

不同类型的森林土壤具备丰富的生物多样性及特殊的地理环境，成为微生物多样性的富集地及功能微生物的天然资源库。

土壤微生物是森林群落的重要组成部分之一，对物质的循环和转化起着重要作用(张海涵，2008)。

土壤微生物通过自身的生理生化活动将动植物残体分解，促进
有机物的矿物质化，进而增加土壤肥力。

我国对森林土壤微生物的研究始于20世纪50年代末，在林地土壤微生物区系、根际微生物区系、固氮作用、生态平衡，以及微生物在土壤养分转化与循环、营林措施对土壤微生物的影响等许多方面做了大量工作(中国农业百科全书编辑部，1996;王岩等，1996;Carter，1986)。

土壤微生物群落在森林土壤的形成与发育、生物元素循环、土壤团粒结构的形成以及食物链网的组成等方面具有十分重要的作用和地位。

同时，地上植被通过植物根系的分泌物及凋落物的种类、数量、质量和凋落时间等对土壤微生物群落的区系组成、结构以及功能等产生显著影响(Hooper et al.，2000)，并且进一步影响土壤
的物理结构、化学组成和生物活性(Lucas et al.，1993)。

植物通过对输入到土壤
中的有机物质的量和质的不同而对土壤微生物过程产生巨大影响。

同时，土壤微生物群落则通过对植物残体的分解以及矿化作用而对植物生长发育产生影响(杨万勤
等，2006;2008)。

土壤微生物数量与生物量是研究和评价土壤微生物调控功能的
重要参数(刘满强等，2003;Harris，2003;徐惠风等，2004)。

微生物的数量、分
布与组成在很大程度上影响并决定着土壤的生物活性，在有机质分解、腐殖质合成、土壤团聚体形成以及土壤养分转化等方面具有关键作用(徐惠风等，2004)。

本试验旨在对四川卧龙自然保护区落叶阔叶天然林土壤微生物分布特征进行研究，获取纯培养菌株，并利用选择性培养基筛选功能微生物，获得纤维素分解菌、木质素分解菌、溶磷菌和固氮菌。

研究“林木-微生物-土壤”系统中微生物的数量与类群变化对评价森林生态功能有重要意义。

1 研究区域概况
四川省卧龙自然保护区位于岷江上游阿坝州汶川县境内，总面积2 000 km2，是
四川省最大的自然保护区之一。

该区气候垂直变化明显。

选择位于保护区内核桃坪的天然落叶阔叶混交林作为样地。

该样地海拔1 900～2 100 m;年最高温度
29.2℃，最低温度-8.5℃;年平均降水量861.8 mm，大多集中在5—9月;年平均
相对湿度80%左右。

土壤为山地棕壤。

植被有山毛榉科(Fagaceae)、樟科(Lauraceae)等科的常绿树种，以及桦木科(Betulaceae)、胡桃科(Juglandaceae)、槭树科(Aceraceae)等科的落叶树种，局部地区有连香树(Cercidiphyllum japonicum)、珙桐 (Davidia involucrata)、水青树(Tetracentron sinensa)、领
春木(Eupulea pleiosperma)、稠李(Prunus padus)等珍稀的古老孑遗植物伴生;
灌木层主要以拐棍竹(Fargesia spathacea)、多鳞杜鹃 (Rhododendron polylepis)、腊连绣球(Hydrangea strigosa)、川吊樟(Lindera pulcheriima)、阔叶青风藤(Sabia latifolia)、悬钩子(Rubus corchorifolius)、鸡桑(Morus australis)等为主;草本层主要以蕨类、苔藓、钝叶楼梯草(Elatostema obtusum)、禾草等为主(张万儒等，1990;周世强等，2003;何飞等，2006)。

2 材料与方法
2.1 样品的采集
于2010年7月20日—8月20日，在样地内选取有代表性的3个20 m×20 m 的样方，分别编为LK1、LK2、LK3，每个样方内按 S型选取 3个取样点，挖3个1 m ×1 m ×1 m土壤剖面，按 FH、A、B、C分层取样。

将土壤样品装入已灭菌的土壤袋中，放入4℃冰箱保存，并在2天内进行微生物区系分析;同时详细记载采样位置及主要植被组成。

2.2 微生物的区系分析
2.2.1 培养基细菌:用牛肉膏蛋白胨培养基;放线菌:用淀粉硝酸盐培养基(高氏一号培养基);真菌:用孟加拉红链霉素培养基(中国科学院南京土壤所微生物室，1985)。

2.2.2 细菌、真菌、放线菌的测定精确称取30.00 g新鲜土壤样品加入内盛270.00 mL无菌水的三角瓶中，150 r·min-1振荡 30 min，吸取 1.00 mL土壤悬浊液加入装有9.00 mL无菌水的大试管中，依次稀释成 10-1，10-2，10-3，10-4土壤悬浊液。

细菌FH和A层用采用土壤悬浊液的稀释度为10-4，B层稀释度为10-3，C层为稀释度10-2土壤悬浊液接种;真菌FH层采用稀释度为10-3，A 及B层采用稀释度为10-2，C层采用稀释度为10-1的土壤悬浊液接种;放线菌FH 层采用稀释度为10-4，A层采用稀释度为10-3，B层采用稀释度为10-2，C层采用稀释度为10-1的土壤悬浊液接种。

每一处理3个重复，接种后倒置培养于28℃温箱内，其中细菌数量在培养24～36 h内计数，真菌菌落在培养3～5天内计数，放线菌菌落在培养10～12天内计数。

采用稀释平板法进行菌落计数:每克干土中的菌数=菌落平均数×稀释倍数/风干土所占质量百分比。

2.2.3 初筛菌种的纯化和保存利用稀释平板法获取实验所用的细菌、放线菌、真菌的单个菌落，经多次平板划线进行纯化，纯化后接种于试管内置4℃冰箱内保存。

以上实验方法依据为《土壤微生物分析法》《土壤微生物分析方法手册》《土壤微
生物实验法》(土壤微生物研究会，1983;中国科学院南京土壤研究所微生物室，1985;许光辉等，1986)。

2.3 功能性菌株的筛选
2.3.1 纤维素分解菌的筛选在羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethyl cellulosea，CMC-Na)培养基平板上接种待测菌进行培养(细菌、真菌、放线菌培
养时间分别为4，6，7天)，培养后用刚果红进行染色。

根据透明圈的大小，比较其分解纤维素的效果(黄宁珍等，2009;史国翠等，2010;周红霞等，2010;魏亚琴等，2010)。

2.3.2 木质素分解菌的筛选 1)苯胺蓝平板脱色法:以苯胺蓝培养基为筛选培养基，接种实验菌株，菌落周围若出现脱色圈证明菌株产生木质素过氧化物酶(lignin peroxidase，Lip)和锰过氧化物酶(manganese peroxidase，Mnp)。

无脱色圈则没有 LiP或MnP产生。

2)利用愈创木酚变色圈法:以鲜艳而均匀的红棕色变色圈的有无来定性检测漆酶的
产生与否。

有红棕色变色圈说明有漆酶的产生，无红棕色变色圈则没有漆酶产生(杨金水等，2006;吴薇等，2008;蒋荣清等，2010)。

2.3.3 溶磷菌的筛选在无机磷Ca3(PO4)2为唯一磷源的培养基平板上均分为4个
小区接种实验菌株，并在28℃条件下培养(细菌4天、真菌6天、放线菌7天)。

根据是否产生透明圈确定是否具有溶磷作用，根据溶磷圈直径与菌落直径的比值大小初步确定各个菌株解磷能力的大小。

每个菌株3次重复(刘晓芳等，2003;焦如
珍等，2005;张毅民等，2006)。

2.3.4 固氮菌的筛选利用无氮平板进行固氮菌筛选，接种实验菌株，进行平板划线，28℃培养1～3天;在无氮培养基上连续转接3次仍生长良好的菌株就说明其具有
固氮能力(杨从发等，1999;蒲一涛等，1999;蒋宝贵等，2005)。

3 结果与分析
3.1 卧龙自然保护区落叶阔叶林植被特征
对核桃坪落叶阔叶林的3个典型样方进行了植被调查，由表1可知:枯枝落叶层的
厚度在3个样方间有差异，其中样方2枯枝落叶层厚度最大，依次为LK2＞LK1＞LK3;乔木层郁闭度样方3明显高于样方1和样方2，样地1和样方2基本一致;灌
木层盖度差异较大，LK3、LK1、LK2分别为94%，46%和23%;草本层盖度也存
在明显差异，依次为LK2＞LK3＞LK1。

表1 不同样方植被分布情况Tab.1 Forest vegetation distribution in different plots乔木层郁闭度灌木层盖度草本层盖度枯枝落样方CanopyCoverage ofCoverage of叶层厚度Plotdensity ofshrub(%)herb(%)Thickness of arborlitter/cm LK1 0.65 46 12 6.17 LK2 0.65 23 63 6.67 LK3 0.80 94 28 5.50 3.2 土壤微生物垂直分布特征
由表2可知，落叶阔叶林土壤中FH、A土层的细菌、放线菌和真菌数量显著高于其他层次。

这可能与有机质分布有关，即有机质在FH及A土层中所占比例较高，再加上大量土壤动物也主要在此层活动，动植物残体为微生物提供了充足的有机物质、养分和水，良好的土壤通气条件也有利于微生物的繁殖。

且表层土壤与空气进行热交换，其土壤热值状况比下层好，利于微生物生长(倪彬等，2007)。

另外，FH及A土层是根须密集区，根系代谢能够提供较多的能源和养分(张健等，2008;王敬国，1993)，其分泌物促进了微生物的生长繁殖。

微生物的数量垂直分布规律与植被的盖度及枯枝落叶层的厚度有关，LK1的FH层细菌、放线菌和真菌数量均比LK2、LK3都多，可能是因为LK1的枯枝落叶中乔、灌、草结构及比例适当，
利于微生物的繁殖与生长。

表2 土壤各类群微生物数量垂直分布Tab.2 Vertical distribution of the amounts of different microorganisms in soil土壤层次细菌
Bacteria/(106cfu·g-1 dry soil ) 放线菌Actinomycete/(105cfu·g-1 dry soil ) 真
菌Fungi/(104cfu·g-1 dry soil)Soil layer LK1 LK2 LK3 LK1 LK2 LK3 LK1 LK2 LK3 FH 587.13 529.42 258.57 1567.46 559.96 504.96744.87 205.46 260.53 A 65.41 45.78 138.61 36.19 26.51 22.09 33.14 13.91 26.71 B 14.24 9.31 12.58 4.34 2.21 5.18 7.31 6.52 4.27 C 11.8 1.27 1.44 0.99 0.31 1.04 0.52 0.89 0.26 3.3 功能性菌株的筛选
由表3可知，通过对四川卧龙自然保护区落叶阔叶林土壤微生物区系的分析，根据菌落形态、质地、颜色等特征，分离纯培养菌株细菌118株、真菌66株、放线菌56株。

表3 几种类型功能菌株的数量分布Tab.3 Distribution of the number of functional microorganism菌类细菌真菌放线菌MicroorganismBacteriaFungiActinomycetes种类总数Total species number 118 66 56固氮菌Nitrogen fixing microorganism 2 0 0溶磷菌Phosphorus dissolving microorganism 59 19 19纤维素分解菌Lignocellulose2 10 16 decomposing microorganism木质素分解菌(Lip或Mnp)Lign2 25 3 decomposing microorganism(Lip，Mnp)木质素分解菌(产漆酶)0 5 0 Lign decomposing microorganism(Laccase)
其中，利用选择性培养基CMC-Na平板筛选出分解纤维素的细菌2株、真菌10株、放线菌16株。

森林凋落物50%以上是由纤维素组成的，纤维素分解菌能将纤维素和半纤维素分解成为各种糖类，提供植物生长所需的碳源和能源，因此，纤维素分解菌对土壤中森林凋落物的分解起着极其重要的作用。

通过无氮平板筛选出固氮菌2株，固氮菌能将大气中游离氮转化成氨，再进一步将其转化成硝酸盐供植物吸收利用，对于土壤的速效氮素补充和平衡，具有重要的作用。

利用苯胺蓝平板脱色法筛选出具有Lip和Mnp的细菌2株，真菌25株，放线菌
3株，其中产漆酶5株，且均为真菌菌株，可能与土壤微生物分离时间有关。

此外，阔叶树的木质素是由松柏醇和芥子醇的脱氢聚合物构成的愈创木基和紫丁香基木质素，而这2种木质素的分解为主要是真菌，这也是未分离出可产生漆酶的细菌、
放线菌菌株的原因之一。

而草本植物木质素则是由芥子醇、松柏醇、对香豆醇的脱氢聚合物和对香豆酸组成的，结构复杂、稳定，细菌能在一定程度上使木质素的结构发生改性，成为水溶性的聚合产物，但极少使木质素矿化，产生CO2;另外，细菌在木质素降解的过程中主要起着改变木质素结构的间接作用，这种作用有利于真菌分解木质素。

真菌通过其菌丝侵入到含有木质素的物质中，通过菌丝分泌特殊的胞外酶能分解植物细胞壁中的木质素和纤维素，促进它们的解聚和溶解。

此外，放线菌中链霉菌(Streptomyces)、节杆菌(Arthrobacter)及小单胞菌也对木质素的降解有一定的作用。

高效优良的木质素分解菌的筛选对低污染制浆造纸具有重要的意义，具有潜在的经济价值和商业价值。

从Ca3(PO4)2为唯一磷源的培养基平板上筛选出可溶解Ca3(PO4)2的细菌59株、真菌19株、放线菌19株，它们能将土壤中难溶性磷Ca3(PO4)2转化为植物能够吸收利用的可溶性磷，为林地提供有效磷。

磷是植物必需的主要营养元素之一，是植物细胞遗传物质RNA和能量物质ATP的基本构成元素，在整个生命过程中起
着很重要的作用。

我国土壤中的总磷量相当可观，但95%以上的磷以稳定的铝硅
酸盐和磷灰石等无效形式存在(陈延伟等，1960)，植物很难直接利用，绝大多数
农作物及林木都需追施磷肥。

因此，筛选溶磷高效菌株对提高土壤磷的利用率具有重要意义。

4 结论与讨论
各类群微生物数量垂直分布规律一致，均为FH层＞A层＞B层＞C层，这是因为上层土壤通气状况良好，表土根系分泌物较多，为土壤微生物提供了较为良好的通气状况，而下层通气状况较差，生长受到抑制，所以出现了上层大于下层的趋势。

各样地土壤微生物类群数量均为好气性细菌＞放线菌＞真菌。

可能是因为土壤微生物数量、分布与组成在很大程度上影响并决定着土壤的生物活性，在有机质分解、腐殖质合成、土壤团聚体形成以及土壤养分转化等方面具有关键作用(Harris，2003;李延茂等，2004)。

土壤微生物群落结构和功能多样性是土壤质量最敏感的
潜力指标之一(白清云，1997;任天志，2000;滕应等，2004)，并且微生物的数量
与森林郁闭度、林下植被盖度及丰富度等也有关。

由功能菌的筛选可知溶磷菌的种类比分解纤维素、木质素菌种类多。

溶磷菌可为林地有效地提供磷素，使森林植被能更好地生长。

纤维素分解菌和木质素分解菌能将枯落物转化为各种糖类供林木利用，是树木生长碳源和能源的主要来源，在大气碳素的循环中有重要作用，而且它们的分布与土壤的性状、肥力有着密切的关系(赵
小蓉等，2000)。

参考文献
白清云.1997.土壤微生物群落结构的化学估价方法.农业环境保护，16(6):252-256，265.
陈延伟，陈华葵.1960.钾细菌的形态生理及其对磷钾矿物的分解能力.微生物，(2):104-112.
丁玲玲，祁彪，尚占环，等.2007.东祁连山不同高寒草地型土壤微生物数量分布
特征研究.农业环境科学学报，26(6):2104-2111.
何飞，刘兴良，郑少伟，等.2006.四川卧龙自然保护区川滇高山栎矮林在海拔梯
度上的植物种-面积研究.成都大学学报:自然科学版，25(1):31-34
黄宁珍，赵志国，何成新，等.2009.一组降解纤维素细菌的分离筛选及产酶特性研究.广西植物，29(5):683-688.
贾治邦.2009.中国森林资源第七次全国森林资源清查结果.北京:中国林业出版社，11-18.
蒋宝贵，赵斌.2005.解磷解钾自生固氮菌的分离筛选及鉴定.华中农业大学学报，24(1):43-48.
蒋荣清，袁兴中，曾光明，等.2010.一组高效木质素降解复合菌的筛选.应用与环
境生物学报，16(2):247-251.
焦如珍，杨承栋，孙启武.2005.细菌肥料菌株对无效磷的转化利用.林业科学，
41(4):194-198.
李延茂，胡江春，汪思龙，等.2004.森林生态系统中土壤微生物的作用与应用.应
用生态学报，15(10):1943-1946.
刘满强，胡锋，何园球，等.2003.退化红壤不同植被恢复模式下土壤微生物量季
节动态及其指标意义.土壤学报，40(6):937-943.
刘晓芳，任鹏，孔健，等.2003.土壤中溶磷微生物的筛选.山东商业职业技术学院学报，3(3):70-71.
倪彬，张健，冯茂松，等.2007.巨按人工林根系土壤酶活性研究.四川农业大学学报，25(3):311-315.
蒲一涛，钟毅沪.1999.固氮菌和纤维分解菌对固氮的影响.深圳大学学报:理工版，16(4):61-65.
任海，彭少麟.2002.恢复生态学导论.北京:科学出版社.
任天志.2000.持续农业中的土壤生物指标研究.中国农业科学，33(1):68-75.
史国翠，尹文新，李明轩，等.2010.纤维素降解菌的筛选与鉴定.黑龙江畜牧兽医，(19):97-98.
唐志尧，方精云.2004.植物物种多样性的垂直分布格局.生物多样性，12(1):20-28. 滕应，黄昌勇，骆永明，等.2004.铅锌银尾矿区土壤微生物活性及其群落功能多
样性研究.土壤学报，41(1):113-119.
土壤微生物研究会.1983.土壤微生物实验法.北京:科学出版社.
王岩，沈其荣.1996.土壤微生物量及其生态效应.南京农业大学学报，19(4):45-51. 王敬国.1993.微生物与根际中物质的循环.北京农业大学学报，19(4):98-105.
魏亚琴，邵建宁，麻和平，等.2010.纤维素酶高产菌的筛选和鉴定.食品与机械，26(5):19-25.
吴薇，顿宝庆，姜训鹏，等.2008.高效木质素降解菌的分离筛选.食品科学，(3):22-25.
徐惠风，刘兴土，白军红.2004.长白山沟谷湿地乌拉苔草沼泽湿地土壤微生物动态及环境效应研究.水土保持学报，18(3):115-122.
许光辉，郑洪元.1986.土壤微生物分析方法手册.北京:科学出版社.
杨从发，王淑军，陈静，等.1999.自生固氮菌的分离鉴定.淮海工学院学报，
8(3):56-58.
杨金水，刘葳，倪晋仁.2006.木质素降解菌的分离鉴定及木素过氧化物酶的纯化.环境科学，27(5):981-985.
杨万勤，张健.2008.土壤生态研究.成都:四川科学技术出版社.
杨万勤，张健，胡庭兴，等.2006.森林土壤生态学.成都:四川科学技术出版社.
张健，杨万勤.2008.短轮伐期巨按人工林生态系统.四川科学技术出版社.
张海涵.2008.林木菌根真菌与土壤微生物相互关系的研究.杨凌:西北农林科技大学硕士学位论文.
张万儒，庞鸿宾，杨承栋，等.1990.卧龙自然保护区植物生长季节森林土壤水分状况.林业科学研究，3(2):103-112.
张毅民，孙亚凯，吕学斌，等.2006.高效溶磷菌株mp5筛选及活力和培养条件的研究.华南农业大学学报，27(3):61-65.
赵淑清，方精云，宗占江，等.2004.长白山北坡植物群落组成、结构及物种多样性的垂直分布.生物多样性，12(1):164-173.
赵小蓉，林启美，孙炎鑫，等.2000.纤维素分解菌对不同纤维素类物质的分解作用.微生物学杂志，20(3):12-14.
中国科学院南京土壤研究所微生物室.1985.土壤微生物研究法.北京:科学出版社.
中国农业百科全书编辑部.1996.中国农业百科全书(土壤卷).北京:农业出版社，
388-390.
中国农业百科全书编辑部.1989.中国农业百科全书(林业卷).北京:农业出版社，
547-548.
周红霞，江海涛，张红琳，等.2010.纤维素分解菌的分离筛选和产酶条件优化.南
京晓庄学院学报，(6):37-40.
周世强，黄金燕，谭迎春，等.2003.卧龙自然保护区大熊猫栖息地植物群落多样性研究植物群落的聚类分析.四川林勘设计，(3):16-20.
Carter M R.1986.Microbial biomass as index for tillage-induced changes in soil biological properties.Soil Tillage Res，17:29-40.
Harris J A.2003.Measurements of the soil microbial community for estimating the success of restoration.Europe Journal of Soil Science，
54:801-808.
Hooper D U，Bignell D E，Brown V K，et al.2000.Interactions between above-and belowground biodiversity in terrestrial ecosystems:Patterns，mechanisms， and feedbacks.Bioseienee， 50:1049-1061.
Lucas Y，Luizao F J，Chauvel A R，et al.1993.The relation between biological activity of the rain forest and mineral composition of soil.Science，260:521-523.。