成为粘性末端
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
（1）以NA克隆对应一种mRNA序列 （4）不含内cDNA分子是否可以完
整的反映来源细胞中的表达信息，用库容量衡量。 序列的完整性：5’UTR（体培养基中扩增保存 方法：从平板上挑取已长出的克隆子转 入含适当的抗生素培养基中，混合的细菌 生长数代后，其培养物于-70oC储存（加终的序列过多或过少。
3.保存单个克隆子于含有甘油的培养基中 方法：从直接应用于基因工程操作。
cDNA克隆还可用于真核细胞mRNA的结构和功能
抑制型菌株，可与pUC编码的－半乳糖苷酶氨基端实现互补。 HB101: 用于大规模制备质粒的抑制型菌株，转化效率高 JM101: 可支持带有琥珀突变载体生长的宿主菌 JM109: 支持带有琥珀突变载体生长的重组缺陷的抑制型菌 MZ-1: 温度敏感的溶源性菌株，用于含有噬菌体ＰＬ启动子质
粒载体的宿主菌第二节 基因组的构建与基因分离基因组（gen隆后所获得的重组子群体的总称。理论上讲，这些 重组载体上带有了该生物体的全部基因。
操作：将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成 大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连 接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。
DNA的不完全酶切
目的片段低熔点琼脂糖回收
3、载体与基因组DNA大片段的连接
内切酶，将载体切成三段：左臂、右臂、中间片段
Sal I BamH I EcoR I EcoR I BamH I Sal I
左臂
20kb
可置换区
14kb
右臂
9kb
左臂 右臂
左臂
插入片段 右臂
插入片段 插入片段
直接连接、人工接头或同聚物加尾。 （1） 粘性末端直接连接：数目＝基因组DNA总长
/DNA插入片段的平均长度。 例如：
细菌基因组DNA总长度=4.6 × 106kb 酶切后5kb= 3.1 × 105个克隆
经验值：
N=
ln (1-P的 分布状态，即：高丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较高，分 离基因容易；低丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较低，分离 基因困难；
从cDNA克隆中，不能克隆到基因组DNA 中的非转录区段 序列，不能用于研究基因编码区外侧调控序列的结构与功能。
妙用RNasΒιβλιοθήκη H 这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，
并将其降解成许多小片断。
小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成 冈崎片断。
DNA PolI除去引物并修补后再使用DNA连接酶连 成一整条DNA链。
3’ 5’ 引物
3’
mRNA
5’
3’ 5’
mRNA cDNA第一链 RNaseHL：克隆fragment的平均大小 G：Genome大小 N：所需的重组载体数（克隆数）
For example : 期望值为0.99，插入片断为20kb的 E.coli (4.6×106
bp) 和 human (3×109 bp) 基因组的克隆数的计算
个末端都有相同的粘性末端。 如：Sau3A与BamHI的酶切末端。
（2）人工接头法（adapter） 人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。
接上人工接头
粘性末端
各种酶的接头可以向公司定做或购买。
（3）同聚物加尾
末端转移酶
CCC
CCC
粘性末端
4、重组DNA转化受体细胞
根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞 常见的宿主细胞： DH5:用于铺制与培养质粒平板和粘粒平板的重组缺陷基因由外源DNA片段、载体和宿主组成。
构建基因的载体选用载体能够容载的DNA片体的要求
载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少， 所需的重组子越少。
mRNA的分离纯化
（3）cDNA的合成
① cDNA第一链合成
逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。 用Oligo dT（或随机引物）作引物，合 成cDNA的第一链。
3’AAAAAAA
mRNA
5’
5’ TTTTTTT cDNA 反转录酶
Oligo dT引物
降解mRNA模板
用碱处理或用RNaseH别适用于某些RNA病
毒等的基因组都含有一种mRNA序列，这样在目
的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，因此阳性 杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克隆将 会含有目的基因。
N E.coli=
ln( 1-0.99)
＝1.1 ×103
ln[1-(2×104/4.6×106)]
ln(1-0.99) Nhuman= ln[1-(2 ×104/3 ×109)] = 6.9 ×105
这个例子说明用质粒载体（插入片断5-10kb大承载能力的载体。
2、大片段的制备
① 酶切法：
② 物理切割法：
总DNA分离纯化→物理切割法[超声波（300bp）或 机械搅拌（8kb）]或酶切法（内切酶Sau3A进行局部消 化。可得到10-30kb的随机片断。 ）→分离特定大小 DNA片段
不完全酶解：产生随机性的DNA片段，片段大小取决于内 切酶识别的位点数和酶解程度。 识别4对碱基的内切酶适用于制备1~20kb的DNA片段
例如：人的基因组是 3×109 bp，插入DNA 片断的平均长度如果是1.7×104 bp， 所需的重组载体数：
N= 4.61×Gf = 4.61×13.7××1100
100
458
1000
4603
150000
690774
40×103
50
278
500
2300
750分离
2、大片段的制备
3、载体的制备
4、重组连接 5、包装
6A分离纯化→限制显子；cDNA克隆的是不只能反映着mRNA的分子结构，没有包括基因组 的间隔序列al RNA）提取
Trizol试剂提取，或商业化的试剂盒（kit）。
（2）mRNA的分离纯化
分离mRNA用商业化的Oligo dT纤维柱。 mRNA只占总RNA的1%-2%,利用mRNA都含有一段 polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等） 中分离纯化。
于合适的含抗生素的培养基中，菌体生长 到一定浓度后，加入终浓度为30%的甘油， 于-70 oC或-25 oC下保存。
缺点：需保存的克中将确定的克隆筛选出来 探针筛选法：两步录出的DNA称cDNA。
DNA 聚合酶 mRNA
cDNA第一链
去引物 DNA ligase cDNA第二链 cDNA第一链
DNA 聚合酶
mRNA
置换合成法
（4）cDNA与载体连接
在双链cDNA末端接上人工接头（含限制性内切酶 黏性末端），即可与载体连接，转入受体菌。
或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别 加上几个C或G，成为粘性末端。
（2）目前常用的载体
载体系列： 容量为 23 kb
cosmid载体： 容量为 45 kb
YAC： 容量为 1 Mb
BAC:
容量为 300 kb基因组应满足的条件1、的完整性： 因组信息的可重
5’
cDNA第一链
cDNA第二链合成
DNA聚合酶
5’
cDNA第一链
3’
cDNA第二链
去掉发卡结构 用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致
cDNA中有用的序列被切掉！）。
5’
cDNA第一链
3’
cDNA第二链
核酸酶S1
5’
cDNA第一链
3’
3’
cDNA第二链
5’
自身引导法
③ cDNA第二链合成（置换合成法）
接上人工接头
粘性末端
末端转移酶
CCC
CCC后杂交 放射自显影
Genomic library与cDN序列、调控基因，cDNA克 隆的是具有蛋白质产物的结构基因。
3分’ 子中的mRNA。 mRNA
5’
5’ 引物
cDNA
反转录酶
3’
mRNA
5’
5’ 引物
cDNA第一链
3’
碱 或RNaseH
5’ 引物
cDNA第一链
3’
② cDNA第二链合成（自身引导法）
剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的 双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条 cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA。
3’
mRNA
5’
5’ 引物 cDNA 反转录酶
3’ cDNA library
将某一生物的特定组织或特定发育时期细胞内的全部 mRNA反转录成cDNA，与适当的载体连接后转化受体菌， 则每个细菌含有一段cDNA，这些cDNA克隆（包含着细胞 全部mR片段 平均大小 （bp）
5×103
2×106（细菌）
理论克 实际克隆
隆数
数
400
1831
基因组大小/bp
2×107 （真菌）
2×109（动物）
理论克隆 数
实际克隆数
理论克隆数
实际克隆数
4000
18418
600000
2763110
10×103
200
919
2000
9208
300000
1381550
20×103
整的反映来源细胞中的表达信息，用库容量衡量。 序列的完整性：5’UTR（体培养基中扩增保存 方法：从平板上挑取已长出的克隆子转 入含适当的抗生素培养基中，混合的细菌 生长数代后，其培养物于-70oC储存（加终的序列过多或过少。
3.保存单个克隆子于含有甘油的培养基中 方法：从直接应用于基因工程操作。
cDNA克隆还可用于真核细胞mRNA的结构和功能
抑制型菌株，可与pUC编码的－半乳糖苷酶氨基端实现互补。 HB101: 用于大规模制备质粒的抑制型菌株，转化效率高 JM101: 可支持带有琥珀突变载体生长的宿主菌 JM109: 支持带有琥珀突变载体生长的重组缺陷的抑制型菌 MZ-1: 温度敏感的溶源性菌株，用于含有噬菌体ＰＬ启动子质
粒载体的宿主菌第二节 基因组的构建与基因分离基因组（gen隆后所获得的重组子群体的总称。理论上讲，这些 重组载体上带有了该生物体的全部基因。
操作：将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成 大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连 接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。
DNA的不完全酶切
目的片段低熔点琼脂糖回收
3、载体与基因组DNA大片段的连接
内切酶，将载体切成三段：左臂、右臂、中间片段
Sal I BamH I EcoR I EcoR I BamH I Sal I
左臂
20kb
可置换区
14kb
右臂
9kb
左臂 右臂
左臂
插入片段 右臂
插入片段 插入片段
直接连接、人工接头或同聚物加尾。 （1） 粘性末端直接连接：数目＝基因组DNA总长
/DNA插入片段的平均长度。 例如：
细菌基因组DNA总长度=4.6 × 106kb 酶切后5kb= 3.1 × 105个克隆
经验值：
N=
ln (1-P的 分布状态，即：高丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较高，分 离基因容易；低丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较低，分离 基因困难；
从cDNA克隆中，不能克隆到基因组DNA 中的非转录区段 序列，不能用于研究基因编码区外侧调控序列的结构与功能。
妙用RNasΒιβλιοθήκη H 这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，
并将其降解成许多小片断。
小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成 冈崎片断。
DNA PolI除去引物并修补后再使用DNA连接酶连 成一整条DNA链。
3’ 5’ 引物
3’
mRNA
5’
3’ 5’
mRNA cDNA第一链 RNaseHL：克隆fragment的平均大小 G：Genome大小 N：所需的重组载体数（克隆数）
For example : 期望值为0.99，插入片断为20kb的 E.coli (4.6×106
bp) 和 human (3×109 bp) 基因组的克隆数的计算
个末端都有相同的粘性末端。 如：Sau3A与BamHI的酶切末端。
（2）人工接头法（adapter） 人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。
接上人工接头
粘性末端
各种酶的接头可以向公司定做或购买。
（3）同聚物加尾
末端转移酶
CCC
CCC
粘性末端
4、重组DNA转化受体细胞
根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞 常见的宿主细胞： DH5:用于铺制与培养质粒平板和粘粒平板的重组缺陷基因由外源DNA片段、载体和宿主组成。
构建基因的载体选用载体能够容载的DNA片体的要求
载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少， 所需的重组子越少。
mRNA的分离纯化
（3）cDNA的合成
① cDNA第一链合成
逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。 用Oligo dT（或随机引物）作引物，合 成cDNA的第一链。
3’AAAAAAA
mRNA
5’
5’ TTTTTTT cDNA 反转录酶
Oligo dT引物
降解mRNA模板
用碱处理或用RNaseH别适用于某些RNA病
毒等的基因组都含有一种mRNA序列，这样在目
的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，因此阳性 杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克隆将 会含有目的基因。
N E.coli=
ln( 1-0.99)
＝1.1 ×103
ln[1-(2×104/4.6×106)]
ln(1-0.99) Nhuman= ln[1-(2 ×104/3 ×109)] = 6.9 ×105
这个例子说明用质粒载体（插入片断5-10kb大承载能力的载体。
2、大片段的制备
① 酶切法：
② 物理切割法：
总DNA分离纯化→物理切割法[超声波（300bp）或 机械搅拌（8kb）]或酶切法（内切酶Sau3A进行局部消 化。可得到10-30kb的随机片断。 ）→分离特定大小 DNA片段
不完全酶解：产生随机性的DNA片段，片段大小取决于内 切酶识别的位点数和酶解程度。 识别4对碱基的内切酶适用于制备1~20kb的DNA片段
例如：人的基因组是 3×109 bp，插入DNA 片断的平均长度如果是1.7×104 bp， 所需的重组载体数：
N= 4.61×Gf = 4.61×13.7××1100
100
458
1000
4603
150000
690774
40×103
50
278
500
2300
750分离
2、大片段的制备
3、载体的制备
4、重组连接 5、包装
6A分离纯化→限制显子；cDNA克隆的是不只能反映着mRNA的分子结构，没有包括基因组 的间隔序列al RNA）提取
Trizol试剂提取，或商业化的试剂盒（kit）。
（2）mRNA的分离纯化
分离mRNA用商业化的Oligo dT纤维柱。 mRNA只占总RNA的1%-2%,利用mRNA都含有一段 polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等） 中分离纯化。
于合适的含抗生素的培养基中，菌体生长 到一定浓度后，加入终浓度为30%的甘油， 于-70 oC或-25 oC下保存。
缺点：需保存的克中将确定的克隆筛选出来 探针筛选法：两步录出的DNA称cDNA。
DNA 聚合酶 mRNA
cDNA第一链
去引物 DNA ligase cDNA第二链 cDNA第一链
DNA 聚合酶
mRNA
置换合成法
（4）cDNA与载体连接
在双链cDNA末端接上人工接头（含限制性内切酶 黏性末端），即可与载体连接，转入受体菌。
或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别 加上几个C或G，成为粘性末端。
（2）目前常用的载体
载体系列： 容量为 23 kb
cosmid载体： 容量为 45 kb
YAC： 容量为 1 Mb
BAC:
容量为 300 kb基因组应满足的条件1、的完整性： 因组信息的可重
5’
cDNA第一链
cDNA第二链合成
DNA聚合酶
5’
cDNA第一链
3’
cDNA第二链
去掉发卡结构 用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致
cDNA中有用的序列被切掉！）。
5’
cDNA第一链
3’
cDNA第二链
核酸酶S1
5’
cDNA第一链
3’
3’
cDNA第二链
5’
自身引导法
③ cDNA第二链合成（置换合成法）
接上人工接头
粘性末端
末端转移酶
CCC
CCC后杂交 放射自显影
Genomic library与cDN序列、调控基因，cDNA克 隆的是具有蛋白质产物的结构基因。
3分’ 子中的mRNA。 mRNA
5’
5’ 引物
cDNA
反转录酶
3’
mRNA
5’
5’ 引物
cDNA第一链
3’
碱 或RNaseH
5’ 引物
cDNA第一链
3’
② cDNA第二链合成（自身引导法）
剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的 双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条 cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA。
3’
mRNA
5’
5’ 引物 cDNA 反转录酶
3’ cDNA library
将某一生物的特定组织或特定发育时期细胞内的全部 mRNA反转录成cDNA，与适当的载体连接后转化受体菌， 则每个细菌含有一段cDNA，这些cDNA克隆（包含着细胞 全部mR片段 平均大小 （bp）
5×103
2×106（细菌）
理论克 实际克隆
隆数
数
400
1831
基因组大小/bp
2×107 （真菌）
2×109（动物）
理论克隆 数
实际克隆数
理论克隆数
实际克隆数
4000
18418
600000
2763110
10×103
200
919
2000
9208
300000
1381550
20×103