肺炎克雷伯菌钼酸盐转运体modA基因缺失株的构建及其生物学特性

肺炎克雷伯菌作为临床上继大肠埃希菌后的主要条件致病菌，可引起多部位的感染，包括尿路感染、菌血症、肺炎、肝脓肿和脑膜炎等，尤其是K1、K2血清型，目前已成为临床细菌性肝脓肿的主要致病菌，其日益严峻
的耐药形势也令人堪忧［1-3］。

肠杆菌科兼性厌氧菌在人体肠道炎性环境中主要通过攫取一系列电子受体如硝酸盐（NO 3-）、亚硝酸盐（NO 2-）等进行厌氧呼吸而扩张，从而增加异位感染的易感性，而钼酸盐转运体ModABC 可能在其中发挥了重要作用［4,5］。

有研究显示，大肠埃希菌进行厌氧硝酸盐呼吸的关键酶是硝酸还原酶，而硝酸还原酶的活性中心为含有钼（Mo ）的钼辅因子MoCo ，Mo 的转运则离不开钼酸盐转运系统
Construction and characterization of a modA gene mutant strain of Klebsiella pneumoniae
WANG Hui 1,4,JIANG Xiaoyu 2,LI Feiyu 3,4
1
Department of Clinical Laboratory,Huangshi Maternity and Children's Health Hospital (Affiliated Maternity and Children's Health Hospital of Hubei Polytechnic University),Huangshi 435000,China;2Huangshi Aier Eye Hospital,Huangshi 435000,China;3Clinical Laboratory,Huangshi Hospital of TCM,Huangshi 435000,China;4School of Basic Medical Sciences,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China
摘要：目的利用同源重组技术构建肺炎克雷伯菌NTUH-K2044株钼酸盐转运系统modA 基因缺失株和回补株，探讨modA 基因
对肺炎克雷伯菌厌氧硝酸盐呼吸生长及表型的影响。

方法利用自杀载体pKO3-Km 质粒构建modA 基因缺失株，同时扩增包含modA 基因启动子、开放阅读框（ORF ）和终止子区域的整条序列片段，将其克隆至pGEM-T-easy 质粒中获得重组质粒modA -pGEM-T-easy ，电转化至modA 缺失株中得到回补株C-modA ，通过体外厌氧硝酸盐呼吸生长测定、竞争力指数实验、生物膜结晶紫定量实验、黏度定量实验以及菌株形态Image J 测量法比较分析NTUH-K2044野生株、modA 基因缺失株、回补株的厌氧硝酸盐呼吸生长、细菌竞争力、生物膜合成能力及超黏表型、菌株形态改变。

结果利用自杀载体pKO3-Km 质粒成功构建肺炎克雷伯菌modA 基因缺失株ΔmodA ；随后将重组质粒modA -pGEM-T-easy 电转化入ΔmodA 中，得到回补株C-modA ；相较于肺炎克雷伯菌野生株（WT ）、C-modA ，modA 基因缺失株厌氧硝酸盐呼吸生长受抑制；ΔmodA 相对野生株WT 的体外厌氧培养竞争力明显减弱（P <0.05）；ΔmodA 厌氧生长生物膜合成减少，与WT 、C-modA 差异具有统计学意义（P <0.05）；modA 基因缺失株厌氧条件下黏液表型明显被削弱，相对WT 、C-modA 差异具有统计学意义（P <0.01）；厌氧条件下ΔmodA 菌体形态由正常的短杆状变为球型，与WT 、C-modA 长度差异有统计学意义（P <0.0001）。

结论钼酸盐转运系统编码基因modA 与肺炎克雷伯菌的厌氧硝酸盐呼吸、细菌体外竞争力、生物膜形成、超黏表型以及菌体形态变化等致病力因素相关。

关键词：肺炎克雷伯菌；ModA 蛋白；厌氧生长；菌体形态
Abstract:Objective To construct a mutant strain of Klebsiella pneumoniae NTUH-K2044with modA gene deletion and its complementary strain and explore the role of modA gene in modulating anaerobic nitrate respiratory growth and phenotypes of K.pneumoniae .Methods The modA deletion mutant K.pneumoniae strain was constructed by homologous recombination using the suicide vector pKO3-Km.To obtain the complementary strain C-modA ,the whole sequence fragment containing the promoter,open reading frame and terminator regions of modA was cloned into pGEM-T-easy and electrically transformed into the modA deletion mutant.The NTUH-K2044wild-type strain,modA gene deletion mutant and complementary strain were compared by measuring in vitro anaerobic nitrate respiration growth,competitiveness index,biofilm quantification,mucoviscosity assay and morphological measurement using Image J.Results The modA deletion mutant strain ΔmodA and the complementary strain C-modA were successfully constructed.The modA gene knockout strain showed inhibited anaerobic nitrate respiratory growth compared with the wild-type and C-modA strains with significantly weakened competitiveness,reduced capacity of biofilm synthesis during anaerobiosis,and lowered mucoviscosity under anaerobic conditions.The ΔmodA strain showed a spherical morphology in anaerobic conditions as compared with the normal short rod-like morphology of K.pneumoniae ,with also distinctly shorter length than the wild-type and C-modA strains.Conclusion The molybdate transport system encoding gene modA is associated with the pathogenic capacity of K.pneumoniae by modulating its anaerobic nitrate respiration,competitiveness,biofilm formation,hypermucoviscous phenotype and morphology.Keywords:Klebsiella pneumoniae ;ModA protein;anaerobic growth;bacterial morphology
收稿日期：2023-05-16
基金项目：湖北医药学院研究生科技创新项目（YC2020004）作者简介：王慧，硕士，主管技师，E-mail:********************通信作者：李飞雨，硕士，初级技师，E-mail:****************doi 10.12122/j.issn.1673-4254.2024.04.17J South Med Univ,2024,44(4):748-756
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ModABC［6-8］。

通过对高毒力肺炎克雷伯菌NTUH-K2044（K1血清型超黏表型）［9］全基因组分析，发现该菌株中也存在着完整的MoCo合成途径以及多达9个硝酸还原酶编码基因。

课题组前期蛋白质谱研究数据显示，编码肺炎克雷伯菌毒力控制因子CRP的基因被敲除后，细菌蛋白ModA的表达量出现明显下降［10］。

CRP 作为全局调控因子，其对肺炎克雷伯菌的菌毛、生物膜形成、体外生长和致病发挥着重要作用［11］。

Liu等［10］研究也显示在易感条件下，cAMP-CRP能够通过调控相关基因的表达以改变细菌的形态，而这对增强细菌致病力有重要意义。

那ModABC系统对肺炎克雷伯菌体外厌氧生长及毒力又会有怎样的影响？本研究通过同源重组敲除肺炎克雷伯菌钼酸盐转运系统modA基因［12］，分析该基因对肺炎克雷伯菌NTUH-K2044厌氧硝酸盐呼吸和生物膜、超黏表型等毒力因素形成的作用，及在此过程中与菌体形态改变这一致病因素的关系。

本研究将有助于为临床治疗耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌感染提供新思路。

1材料和方法
1.1材料
1.1.1菌株和质粒本实验所用高毒力野生型肺炎克雷伯菌NTUH-K2044、温敏型自杀载体pKO3-km（携卡那霉素抗性基因）质粒均获赠于军事医学院微生物流行病研究所。

所涉回补质粒pGEM-T-easy、荧光质粒pLac-EGFP（绿色荧光）、pBBR1MCS2-Tac-mCherry （红色荧光）以及质粒保存菌株Escherichia coli DH5α等均由本实验室保存。

1.1.2主要试剂和仪器细菌DNA提取试剂盒（Omega Bio-Tek），质粒提取试剂盒、PCR回收试剂盒、胶回收试剂盒（QIAGEN），2×Phusion Master Mix、限制性内切酶（NewEngland Biolabs），T4DNA连接酶（宝生物工程），Marker、FastPfu DNA聚合酶（北京全式金生物技术有限公司），蔗糖和葡萄糖（BioFroxx），氨苄青霉素（Amp）、硫酸卡那霉素（Kan）、5%绵羊血平板（北京博奥拓达科技有限公司），硝酸钾（天津市天力化学试剂有限公司的），结晶紫（sigma）；PCR仪（Bio-Rad），厌氧培养箱（DonWhitley Scientific），酶标仪、紫外-可见分光光度计（Gene），多功能生物分子成像仪（General Electric），普通/荧光显微镜（OLYMPUS）。

所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司武汉分公司合成（表1）。

Purpose
Knockout strain construction(External primer) Knockout strain identification(Internal primer) Complementary strain construction Sequencing(pKO3-Km)
Sequencing(pGEM-T-easy)
Primers name
modA-A
modA-B
modA-C
modA-D
modA-F
modA-R
C-modA-F
C-modA-R
pKO3-Km-F
pKO3-Km-R
pGEM-T-easy-km-F
pGEM-T-easy-km-R
Primers sequence(5'→3')
GTATGCGGCCGCATCCACCAACGGATGTTCGC
GCCCTTTCAGGTAGTCATAGCTTACTCTCCTGTCAATGCG
CGCATTGACAGGAGAGTAAGCTATGACTACCTGAAAGGGC
GTATGCGGCCGCCAACGGCAACGTAATGGTC
ATGGCAGGTTCTTGGTTACG
ACTTTCTGATGCGAGGCTTC
ATGGGCCCGAGATGGCCGCCAGCAGG
TAAAGCGGCCGCTCAGCGGGTGGTAAATCCGT
AATAAGCGGATGAATGGCAG
TCCCTCACTTTCTGGCTGG
GCGAATTGGGCCCGACGTC
CGCAGCCGAACGACCGAG
表1引物序列
Tab.1Primers sequences used in this study Underlined indicate restriction enzyme sites.
1.2方法
1.2.1肺炎克雷伯菌modA基因缺失株的构建提取野生型肺炎克雷伯菌NTUH-K2044基因组DNA，分别以引物对modA-A/B及引物对modA-C/D扩增并纯化回收得到肺炎克雷伯菌钼酸盐转运体modA基因上、下游同源臂片段（分别为639bp和498bp），PCR反应体系（20μL）：细菌基因组DNA0.5μL，引物modA-A/B（或modA-C/D，10μmol/L）各0.5μL，2×PhusionMaster
Mix10.0μL，ddH2O8.5μL（PCR反应条件：94℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃20s，30个循环；72℃5min）。

以引物对modA-A/D通过融合PCR将该上、下同源臂进行连接得到敲除元件（1137bp），PCR反应体系（50μL）：上述上、下游同源臂片段DNA各1μL，引物modA-A/D（10μmol/L）各1μL，2×Phusion Master Mix25μL，ddH2O21μL（PCR反应条件：94℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃5min，2个循环；94℃30，
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56℃30s ，72℃45s ，30个循环；72℃5min ）。

将其敲除元件连接入温敏型自杀载体pKO3-km 质粒上的Not I 酶切位点形成新的重组质粒modA -pKO3-km ，并化学转化进入Escherichia coli DH5α中保存备用。

提取纯化重组质粒modA -pKO3-km ，电转入野生型NTUH-K2044中，置43℃（LB 平板，50μg/mL Kan ）压力下培养，使modA -pKO3-km 通过第1次同源重组整合入WT 基因组DNA 中，挑选大的菌落作为模板，以引物对modA -A/D 进行PCR 扩增，筛选出产物明显小于阳性对照（野生株DNA 为模板）的单菌落（重组子）3到5个混合接种于无抗性LB 肉汤中（抗性松弛）30℃过夜摇菌，使发生二次同源重组（modA -pKO3-km 从重组子上脱落），转接到LD 平板（含蔗糖5g/100mL ），置30℃过夜培养，挑取尽可能多的菌落进行反向筛选，得到在Amp 抗性LB 平板上能长而Kan 抗性LB 平板上不能长的单菌落，用引物对modA -A/D 对以上菌落进行PCR 鉴定，并送生工生物工程（上海）股份有限公司测序确定得到modA 基因无痕缺失株。

1.2.2modA 基因回补株的构建以野生型肺炎克雷伯菌NTUH-K2044基因组DNA ，用引物对C-modA -F/R 扩增得到包含modA 上游启动子、ORF 和下游终止区域共计1594bp 的基因片段。

PCR 反应体系（50μL ）：细菌基因组DNA 1μL ，引物C-modA -F/R （10μmol/L ）各1μL ，5×FastPfu Buffer 10μL ，dNTPs （2.5mmol/L ）4μL ，FastPfu DNA 聚合酶（2.5U/μL ）1μL ，ddH 2O 32μL （PCR 反应条件：94℃2min ；94℃20s ，65℃30s ，72℃1min ，30个循环；72℃5min ）。

连接到回补质粒pGEM-T-easy 的Apa I 和Not I 酶切位点之间得到回补质粒modA -pGEM-T-easy ，电转入modA 缺失株中经测序确认得到回补株C-modA 。

1.2.3细菌厌氧生长曲线及体外竞争力指数测定预培养：由-80℃冰箱取出甘油管保存的肺炎克雷伯菌NTUH-K2044株1∶100接种于LB 液体培养基，37℃、200r/min 摇菌活化至对数期后划线接种于LB 平板，37℃培养长出单菌落备用。

1.2.3.1厌氧硝酸盐呼吸生长挑取肺炎克雷伯菌野生株WT 单菌落接种于3mL LB 培养基37℃摇菌至A 600nm 值1.2后取10μL 接种于2组AT 培养基（无机盐培养基：分别添加0.2%甘油或0.2%葡萄糖）至厌氧箱中连续培养48h ，绘制以NO 3-为厌氧呼吸氮源（最适浓度20mmol/L ）的不同碳源条件下细菌生长曲线，并采用磺胺显色法
（重氮反应）测代谢物亚硝酸盐（NO 2-）浓度以反映2组不同碳源条件下厌氧硝酸盐呼吸水平的差异，具体操作如下：离心后分别取细菌上清液1mL ，向其中顺序加入1mL 1%磺胺酸（溶于25%盐酸）及1mL 0.2%α-萘胺以形成粉红色偶氮化合物，反应体系2250r/min 离心5min 取上清，用酶标仪测定A 540nm ；预培养同上，分别取肺炎克雷伯菌WT 、ΔmodA 、C-modA 菌液各10μL 于2
组AT 培养基（0.2%葡萄糖±20mmol/L KNO 3），转至厌氧培养箱静止培养24h ，以时间为横坐标，A 600nm 值为纵坐标绘制生长曲线。

1.2.3.2体外竞争力试验预培养同上。

取分别携绿色荧光质粒（pLac-EGFP ）肺炎克雷伯菌WT 与携红色荧光质粒（pBBR1MCS2-Tac-mCherry ）肺炎克雷伯菌ΔmodA ，等量混合接种于2组AT 培养基（0.2%葡萄糖±20mmol/L KNO 3）中于厌氧箱静置培养24h ，取菌液稀释涂LB 平板（Amp 与Kan 双抗性）置37℃过夜培养，次日长出单菌落后通过多功能生物分子成像仪成像并计数，由此计算其24h 体外竞争力指数CI （WT/ΔmodA ）。

1.2.4结晶紫染色定量检测modA 缺失株生物膜合成情况分别取过夜活化的肺炎克雷伯菌WT 、ΔmodA 、C-modA 菌液调整A 600nm 为1.2后以1∶100比例转接至3mL 新鲜LB 液体培养基中，37℃厌氧静置培养48h ，观测不同菌株在液体培养基表面生物膜形成的情况。

然后小心吸取各组试管中的菌液至另一洁净试管中，充分混匀后测定各组A 600nm 值。

将原试管贴壁的生物膜以3mL 去离子水轻轻冲洗2遍后加入3mL 0.1%的结晶紫溶液，静染20min 后弃去结晶紫并以去离子水漂洗3次，向每管加入3mL 无水乙醇充分溶解试管壁上的结晶紫并转移至96孔板检测各孔A 590nm ，每孔重复3次，按照A 590nm /A 600nm 计算3组菌株生物膜相对形成量的均值与标准差，采用t 检验进行数据统计分析。

1.2.5细菌拉丝及黏度定量实验观察modA 基因对细菌黏液表型的影响细菌拉丝实验：分别接取对数期肺炎克雷伯菌NTUH-K2044株WT 、ΔmodA 、C-modA 菌液在2组5%绵羊血平板上三区划线，一组置37℃普通培养箱，另一组则置于37℃厌氧培养箱，倒置培养16h ，分别使用200μL 无菌枪头对2组单菌落进行拉丝实验并记录拉丝长度。

以菌落平均拉丝长度超过5mm 作为超黏表型阳性评判标准；黏度定量实验：挑取肺炎克雷伯菌WT 、ΔmodA 、C-modA 单菌落接种于3mL LB 培养基摇菌，6h 后取出调整A 600nm 至1.2，以1∶100稀释转接于2组5mL AT 培养基，分别置37℃有氧和厌氧环境培养，次日取出以PBS 缓冲液洗菌2次后调A 600nm 值至1.0，各取3mL 于无菌离心管中以1000×g 离心力低速离心5min ，测定各组菌液上清A 600nm 值。

1.2.6modA 基因对细菌体外厌氧生长形态变化的影响取过夜活化培养的肺炎克雷伯菌WT 、ΔmodA 、C-modA 调节A 600nm 值1.2后1∶100转接至LB 培养基，置37℃厌氧培养箱培养至对数中期（A 600nm 约1.5），取出菌液均匀涂片固定，为便于观察，分别以硫酸铜染色液及革兰染色试剂盒按操作说明对其进行分组染色，标本于空气中自然晾干后置油镜下观察各组细菌形态特点，截取菌体形态学图片通过Image J 图像处理软件（NeuronJ 插件）
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捕捉分析细菌的长度。

1.2.7统计学分析所涉数据采用SPSS17.0软件进行分析处理。

采用重复测量数据的方差分析，用LSD 法进行事后比较检测各组细菌生长曲线差异；采用配对双尾t 检验来确定同一来源混合菌株间竞争力指数的差异；其他均采用非配对双尾t 检验及单因素方差分析来进行2组或多组间的差异。

当P <0.05被认为差异有统计学意义。

2结果
2.1成功构建肺炎克雷伯菌NTUH-K2044modA 基因缺失株和回补株
经过二次同源重组，在蔗糖平板上杀死脱落的pKO 3-km 质粒后，以外部引物对modA -A/D 进行PCR 鉴
定，共筛选得到2株肺炎克雷伯菌modA 基因缺失株，经
二次重组恢复为野生株的PCR 产物大小为1844bp ，缺失株则为1137bp （图1A ）；图1B 显示为构建modA 无痕缺失株所必须的modA 基因上游639bp 、下游498bp 的同源臂，及以此2段同源臂为模板，modA -A/D 为引物对扩增得到的融合PCR 产物（敲除元件，1137bp ），另以野生株为对照；图1C 为将modA 上游启动子、ORF （编码区）和下游终止子区域克隆至载体pGEM-T-Easy 上再回补到modA 基因缺失株中得到C-modA 后，分别以WT （对照）、ΔmodA 、C-modA 为模板，以modA -F/R 为内部引物对进行鉴定，回补株和对照组大小为653bp ，缺失株未扩出，并经测序最终证实成功构建肺炎克雷伯菌modA 缺失株与回补株。

18441137
1
2
3
4
5
6
M
200015001000750500250100
bp B
1234
18441137
639498
bp 12
653bp
C
A
bp 图1modA 基因缺失突变株与回补株的筛选构建与鉴定
Fig.1Construction and identification of modA deletion mutant and complement strains.A :Result of external primer (modA -A/modA -D)PCR identification of knockout of modA coding region after 2rounds of recombination (Lanes 1and 6:The target strain ΔmodA ).B :Amplification products of upstream homologous recombination arm (modA -A/B;Lane 1),downstream homologous recombination arm (modA -C/D;Lane 2),fusion PCR amplification (modA -A/D;Lane 3)and the wild-type (WT)strain (modA -A/D;Lane 4).C :Results of internal primer (modA -F/modA-R)PCR identification of WT (Lane 1),ΔmodA (Lane 2)and C-modA (Lane 3)strains.
2.2modA 基因与肺炎克雷伯菌NTUH-K2044体外厌氧生长有关
厌氧培养条件下不同浓度NO 3-对肺炎克雷伯菌生长的促进作用存在差异，当浓度为20mmol/L 时，肺炎克雷伯菌的厌氧硝酸盐呼吸生长最为适宜（图2C ）；而在含有20mmol/L KNO 3的AT 培养基中，不同碳源的存在对肺炎克雷伯菌的厌氧呼吸作用也有区别，重复检测数据显示0.2%葡萄糖（GLU ）组肺炎克雷伯菌的厌氧硝酸盐呼吸生长其对数期和稳定期生长趋势明显高于0.2%甘油（GLY ）组（图2A ）。

两组48h 厌氧硝酸盐呼吸生长的代谢产物NO 2-也存在统计学差异（P =0.0218，图2B ）；AT 培养基（0.2%葡萄糖±20mmol/L KNO 3）厌氧培养条件下重复检测生长曲线显示：阴性对照组（不加KNO 3）WT 、ΔmodA 、C-modA 3株细菌均表现为较接近的低水平生长速度，当补充KNO 3后，WT 与C-modA 厌氧生长速度受到了极大的促进，且2组生长曲线差异无统计学意义，而ΔmodA 组细菌则仍处于较低生长水平（图2D ）。

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D A n a e r o b i c g r o w t h A 600n m
1.0
0.80.60.40.20.0
04
812
24
Cultivation time (h)
WT ΔmodA C-modA
ΔmodA +KNO 3WT+KNO 3
C-modA +KNO 3
图2肺炎克雷伯菌WT 、ΔmodA 、C-modA 体外厌氧培养
Fig.2Anaerobic growth curve of WT,ΔmodA and C-modA strains.A ,B :Anaerobic growth curves of WT strain with different carbon sources (A )and the level of nitrate respiratory metabolite NO 2-at 48h after cultivation (B ).C :Anaerobic growth curve of WT strain with different concentration of NO 3-.D :Anaerobic growth curve of WT,ΔmodA and C-modA strains in AT medium (0.2%glucose ±20mmol/L KNO 3).LSD multiple comparison analysis of variance was used to determine the differences in the growth curves;A two-tailed unpaired Student's t test was used to determine the difference in nitrate respiratory metabolite NO 2-of WT strain with different carbon sources.*P <0.05.
A
A n a e r o b i c g r o w t h A 600n m
0.40.30.20.10
12
2436
48
Cultivation time (h)
GLU
GLY
B
*
GLU
GLY
5
43210
N O 2-(A 450n m )
C 0
4
812
24
Cultivation time (h)
A n a e r o b i c g r o w t h A 600n m
1.0
0.80.60.40.20.00.020.4420
2.3modA 基因增强肺炎克雷伯菌NTUH-K2044WT 体外竞争力
KNO 3的存在使得WT 相对ΔmodA 的厌氧生长竞争力指数由对照组（无KNO 3）的1.64增至4.89，2组竞争力差异具有统计学意义（P =0.0374，图3）。

2.4modA 基因缺失后肺炎克雷伯菌NTUH-K2044厌氧生长生物膜合成减少
静置48h 后，肉眼观ΔmodA 菌株生物膜形成量明显低于肺炎克雷伯菌WT 、C-modA ；结晶紫染色定量实验结果显示C-modA 生物膜合成恢复到接近WT 水平。

此外，ΔmodA 生物膜合成与WT 、C-modA 差异具有统计学意义（P <0.05，图4）。

图3肺炎克雷伯菌WT 、ΔmodA 体外厌氧生长竞争力指数
Fig.3Anaerobic growth competitiveness index of WT and ΔmodA strains.A ,B :Fluorescence microscopy of bacterial colony on AGAR plate.C :Bacteria competitiveness index (WT/ΔmodA )at 24h of anaerobic growth.*P <0.05.
Control 20mmol/L KNO 3
C o m p e t i t i v e n e s s i n d e x
(W T /Δm o d A )
108
6420
Control
KNO 3
*
A B
C
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2.5modA 基因缺失后肺炎克雷伯菌NTUH-K2044厌氧生长黏性减弱
2组菌液的菌落拉丝实验结果显示：在有氧条件下，WT 、ΔmodA 在绵阳血平板上生长的单菌落拉丝长度都超过5mm （拉丝阳性）（图5A ）；缺氧条件下，ΔmodA 拉丝明显减弱，菌落呈稀薄的透明状，WT 、C-modA 菌落呈半透明样，黏度相对于有氧条件下也有所减低，但拉
丝仍然>5mm （图5B ）。

经典黏度定量实验结果显示：
有氧条件下，3株菌离心后其上清A 600nm 值均由初始的1.0下降至0.4左右，差异无统计学意义；厌氧组ΔmodA 离心后上清A 600nm 值则仅为0.167，而WT 、C-modA 上清仍呈明显稀薄云雾状，A 600nm 值维持在0.4左右，相对变异株差异有统计学意义（P <0.01，图5C ）。

图4modA 基因对肺炎克雷伯菌生物膜形成的影响
Fig.4Effects of modA on Klebsiella pneumoniae biofilm formation.A :Biofilm formation after 48h of anaerobically static cultivation at 37℃.B :Quantitative analysis of crystal violet stained biofilm.*P
<0.05.
图5modA 基因对肺炎克雷伯菌黏性表型的影响
Fig.5Effect of modA gene on Klebsiella pneumoniae mucoviscous phenotype.Wire-drawing experiment (A ,B )and mucoviscosity
assay (C )were performed on WT,ΔmodA and C-modA strains grown under aerobic and anaerobic conditions.**P <0.01.
WT ΔmodA C-modA
A
B
C
WT ΔmodA C-modA
0.50.4
0.30.20.10.0
A 600n m
Anaerobic growth
Aerobic grouwth
**
**
2.6modA 基因与肺炎克雷伯菌NTUH-K2044厌氧条件下菌落形态变化相关
染色镜检结果显示：有氧状态下WT 、ΔmodA 、C-modA 形态都较为一致，为长杆状；厌氧培养至对数期后，肺炎克雷伯菌WT 、C-modA 菌株仍表现为长杆状，而ΔmodA 菌株则呈现出短杆状或近球形。

Image J 图像处理软件测量分析：WT 、C-modA 长度分别为1.161±0.263μm 和1.229±0.207μm ，二者长度差异无统计学意义；ΔmodA 长度0.831±0.188μm ，明显短于WT 、
C-modA ，差异有统计学意义（P <0.0001，图6）。

3讨论
细菌、真菌以及古生菌等有关碳、氮、硫代谢的关键酶［13,14］，其活性中心广泛存在一个含有Mo 的钼辅因子
MoCo ［15］。

虽然存在Mo 非特异性转运通道如大肠埃希菌SO 42-转运体CysPTWA ［16］，但为了更加适应Mo 浓度
低至纳摩尔级别的自然环境［17］
，绝大多数微生物都进化出了Mo 特异性转运系统-ModABC 蛋白。

已有越来越
A 590n m /A 600n m
*
*
1.2
0.8
0.4
0.0
WT ΔmodA C-modA
B WT ΔmodA C-modA
A
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图6厌氧条件下肺炎克雷伯菌不同菌株形态变化
Fig.6Morphological changes of WT,ΔmodA and C-modA strains under anaerobic conditions.A :Morphological changes of the strains with copper sulfate staining and Gram staining.B :Comparison of the lengths of the 3strains measured by Image J.****P <0.0001.
WT
ΔmodA
C-modA
WT ΔmodA C-modA
****
****
L e n g t h (μm )
2.01.5
1.00.50.0
B
A
500μm 500μm
500μm
多的证据显示ModABC 转运体与细菌厌氧生长及致病力紧密相关。

在慢性肺部感染模型中，有研究发现铜绿假单胞菌插入突变株STM-modA 相对野生株PAO1的
体内竞争力被极大的削弱［18］
；有研究发现结核分枝杆菌通过水平转移方式获得moaA1-D1基因簇（参与合成
MoCo ）后其耐受缺氧环境的能力得到了明显增强［19］
；有研究利用钨酸盐处理竞争结合肠杆菌科细菌钼酸盐转
运体ModA 蛋白，极大改善了小鼠肠道炎性环境［20］。

同大肠埃希菌一样，分离自肝脓肿患者的高毒力肺炎克雷伯菌NTUH-K2044株基因组中也存在着一个modABC 操纵子（KP1_RS8130/8135/8140）及其上游可能起着调控作用的反向编码序列modE （KP1_RS8120,Mo 浓度依赖性）。

课题组在研究肺炎克雷伯菌全局调控因子CRP 蛋白时，通过细菌蛋白质谱分析发现CRP 能够通过某种机制关联ModA 蛋白的合成水平［10］。

以上提示钼酸盐转运体ModABC 在肺炎克雷伯菌体外厌氧生长、毒力和致病性中可能也发挥着重要作用。

本研究采用同源重组的方法利用自杀载体pKO3-Km 成功构建肺炎克雷伯菌NTUH-K2044modA 基因缺失株ΔmodA ，及回补株C-modA 。

体外厌氧生长曲线及其24h 代谢产物NO 2-浓度水平检测结果提示，0.2%葡萄糖作为碳源且硝酸盐浓度为20mmol/（L·L ）时最适宜细菌厌氧硝酸盐呼吸生长，在此条件下的进一步体外厌氧生长曲线结果显示，相对WT 及回补株C-modA ，缺失株ΔmodA 厌氧硝酸盐呼吸生长受到明显抑制，而在对照组中，3株菌具有相似的低生长趋势，类似的现象
在大肠埃希菌和铜绿假单胞菌等中已有报道［18,21］
，表明ModA 蛋白也能通过促进肺炎克雷伯菌对培养基中NO 3-的转化利用而提高细菌生长能力。

在Winter 等［4］的小鼠肠炎模型中，以大肠埃希菌为代表的肠杆菌科细菌能够利用肠炎副产物硝酸盐而扩张，抑制只能依赖发酵产生能量生长的微生物，而在本研究中，野生株WT 与缺失株ΔmodA 的体外混合培养结果进一步表明了ModABC 系统介导的对Mo 的转运能够促使肺炎克雷伯菌利用环境中有限的硝酸盐以提升细菌竞争力，进而获得厌氧条件下的适应性优势。

细菌合成生物膜具有重要意义，能帮助病原体在致感染过程中躲避抗生素以及机体免疫系统的攻击，其形成过程对营养和环境条件比较苛刻和敏感［22,23］。

已有研究证实铜绿假单胞菌硝酸还原酶缺陷株ΔnarGH 其生物膜厚度、生物量及活细
胞数相较野生株都表现出明显下降［18,24］
，越来越多的临床证据也显示肺炎克雷伯菌的致病性及耐药性增强可能与其在某些感染部位的厌氧环境有关，如导尿管相关泌尿道感染，而生物被膜的形成在其中可能发挥了重要
作用［25］。

在本实验中由于厌氧生长缺陷，肺炎克雷伯菌ΔmodA 菌株的生物膜形成相对野生株也明显减少，提示ModA 蛋白捕捉环境中的Mo 进入细胞并整合形成活性硝酸还原酶，是肺炎克雷伯菌适应厌氧环境合成生物膜的重要条件。

超黏表型与肺炎克雷伯菌的毒力和致病性有关，且其形成也被证明并不依赖于荚膜生物合成过程。

有研究结果提示在抵御宿主细胞粘附内化、提高小鼠机体定植感染方面，肺炎克雷伯菌的超黏表型相较于其荚膜结构可能是更为关键的因素［26］。

本研究中拉丝实验结果显示modA 基因被敲除后，肺炎克雷伯菌NTUH-K2044在缺氧条件下的菌落黏性减弱，而在有氧条件下没有明显变化。

黏度定量实验结果也显示缺
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氧组ΔmodA菌株经低速离心后更容易沉降于管底，而野生株与modA基因回补株肉眼仍可见均匀云雾状，表明肺炎克雷伯菌敲除modA基因后，其在厌氧条件下的超黏表型被削弱；有氧组3株菌低速离心后上清黏度定量实验结果无统计学意义，一个可能的原因是细菌通过有氧呼吸方式获取能量，极大减少了对钼转运和利用系统的依赖。

致病菌在感染机体过程中对巨噬细胞具有诱导分化和趋向吞噬的作用，在课题组前期的小鼠腹腔感染模型中，ΔmodA组在腹腔灌洗液中仅能发现极少数肺炎克雷伯菌以及少量腹腔巨噬细胞，该结果表明在腹腔缺氧环境下细菌致感染和抵御宿主巨噬细胞吞噬的能力减弱，推测与ΔmodA超黏表型被削弱有关。

以上提示缺氧条件下Mo的利用在肺炎克雷伯菌NTUH-K2044超黏表型生物形成过程中可能发挥了重要作用，其具体调控机制有待进一步研究。

肺炎克雷伯菌丢失了modA基因后，其在缺氧条件下不仅生物膜形成能力和超黏表型受到削弱，细胞形态也变短变圆。

特定的形态是细菌长期适应环境压力、优化生存能力的结果，近年的研究也表明，形态的变化可能会影响到细菌的细胞分化功能、对营养的获取、抗逆性以及与其他生物的交互作用［27-29］。

幽门螺杆菌在抗生素亚抑制浓度压力下，其细长的螺旋形态可以转变为不可培养的有活力圆球状，这种形态能够使其在宿主或其他恶劣环境中持久生存［30］，这或许能够解释为什么肺炎克雷伯菌缺失株ΔmodA在丢失了厌氧硝酸盐呼吸生长能力后，其形态会变圆变短。

已有研究显示肺炎克雷伯菌毒力因子cAMP-CRP能够感知周围环境变化而负调控tolB或rcsF，这些基因与细胞分裂或细胞壁形成紧密相关［10］，而在crp基因缺失株中ModA蛋白表达是下调的［10］，提示在缺氧环境下，CRP可能通过调控肺炎克雷伯菌Mod-ABC钼酸盐转运系统功能而在间接负调控tolB或rcsF 路径中发挥了重要作用，具体机制有待探索，但以细菌形态调节通路为靶点，抑制细菌适应环境的形态调节能力，可能是未来临床治疗肺炎克雷伯菌感染的又一潜力方向。

本研究结果表明，modA作为肺炎克雷伯菌NTUH-K2044钼酸盐转运系统的重要编码基因，能够影响细菌在缺氧环境下的生长能力、细菌间的竞争力，也与其生物膜形成、超黏表型等重要毒力因素相关，不仅如此，modA还参与到了肺炎克雷伯菌维持细胞形态，适应外周环境的重要过程，而全局因子CRP可能在其中发挥着重要调控作用。

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