慢病毒简介PPT课件(模板)
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质粒一携带了gag/ pol编码序列及RRE ; 质粒二包含了编码rev的序列; 质粒三是载体质粒; 质粒四表达env。
7
Reagents for calcium phosphate transfection.
Polybrene, 800 μg/mL stock solution in PBS. tat编码的蛋白参与RNA转录的控制。 慢病毒载体系统的另一个特征是携带病毒微粒的表面蛋白，包含HIV受体和共受体，从而改变或扩大的细胞类型的范围，使得该载体可 以结合并且进入。
重组病毒载体已被用于研究各种发育神经生物学 中的基础问题，以及各种神经退行性疾病的发病机 理和治疗。慢病毒载体能转导分裂的细胞，如神经 元，并介导中枢神经系统（CNS）细胞在体内和体 外基因治疗或报道基因而作为神经生物学研究的有 价值的工具。
11
1.1. Lentiviral Gene Delivery to
的基 pol基因编码病毒复制所需的酶，如反转录酶、整合酶、
本结 蛋白酶。
构 env基因编码病毒的包膜糖蛋白，决定病毒感染宿主的 靶向性。
调节 rev编码的蛋白调节gag、pol、env的表达水平。
基因 tat编码的蛋白参与RNA转录的控制。
4个辅助基因vif、vpr、vpu、nef编码的蛋白则作为毒力
CNS Cells
Lentivirus preintegration complexes interact with the nuclear pore and undergo active transport into the nucleus of nondividing cells, where the proviral DNA is integrated into the genomic DNA of the host cell. This feature is the primary reason why lentiviruses are being developed as gene-transfer vectors for postmitotic cells in the CNS.
慢病毒
1
慢病毒载体概况 HIV-1的基因结构 慢病毒载体历史与构建 重组慢病毒的产生 慢病毒在中枢神经系统中的应用 慢病毒在造血干细胞系统中的应用 慢病毒在眼科疾病治疗中的应用
2
1.慢病毒载体概况
慢病毒是逆转录病毒科亚科之一，分为灵长类和 非灵长类慢病毒。灵长类慢病毒包括HIV-1，HIV2，猴免疫缺陷病毒（SIV），非灵长类慢病毒包 括猫免疫缺陷病毒（FIV），牛免疫缺陷病毒 （BIV），马免疫缺陷病毒（EIAV）等，其中HIV 研究最为透彻。
的启动子和增强子序列而无法复制出完整 repeat (LTR) that are copied during reverse transcription to the 5’LTR.
Titering Lentiviral Vectors 滴定慢病毒载体
长度的病毒基因组。 Self-inactivating (SIN) vectors reduce the probability of oncogenesis by pro-moter insertion.
转录后，其5’LTR会因为缺失HIV-1所需要 受鼠脾脏、骨髓及外周血GFP的长期表达。
此外，基因表达被限制在感光体细胞中，是更有效的视紫红质子。
In SIN vectors, viral promoter activity is deleted from the inte-grated provirus by deletions in the U3 region of the 3’ long terminal
and co-receptors, thus changing or expanding the range of cell types that the vector can bind to and enter.
Using an HIV vector carrying the green fluorescent protein (GFP) gene expressed from the cytomegalovirus (CMV) promoter, we
除了病毒3’端LTR的U3区增强子和启动子序 Collection and Concentration of the Viral Supernatant
收集和集中的病毒上清
研究表明，VSV-G假构型HIV-I载体可不经过对HSC的预刺激就能有效地将基因转移到人早期干细胞并能在重度联合免疫缺陷(SCID)鼠
SIN载体的构建是在原病毒载体基础上删 This is done by pseudotyping, which involves replacing the HIV-1 envelope glycoprotein with an envelope glycoprotein from another
virus, such as the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G).
因子参与宿主细胞的识别和感染。两端为长末端重复序 列(LTR)，内含复制所需的顺式作用元件。
4
3.慢病毒载体历史与构建
3.1第一代HIV-1来源的慢病毒载体 以Naldini及Kafri构建的三质粒系统为代表，该系统由包 装质粒、包膜质粒及载体质粒3种质粒组成。 包装质粒是HIV-1前病毒基因组5’端LTR由巨细胞病毒早期 启动子取代，3’LTR由SV40 polyA序列取代。包装成分分 别构建在两个质粒上，一个表达gag和pol，另一个表达 env。 载体质粒携带了5’端LTR，和全部5’端非翻译区域，另外 还带有rev应答元件（RRE）。 包膜表达质粒使用水疱性口炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G) 用来代替了原病毒的env基因。
Vitrectomy for the Large Eye 大眼睛的玻璃体手术治疗
Another feature of the lentiviral vector system is that the virions can carry a surface protein that bypasses the usual HIV receptors
degenerative diseases.
目的基因转移HSC后，可随着HSC的自我更新和分化在体内长期表达，因此HSC是较理想的基因转移靶细胞。
8
4.重组慢病毒的产生
常用瞬时转染法，即将包膜质粒，包装 质粒和载体质粒共转染人胚肾293T细胞直 接产生生产细胞。最后慢病毒分泌到培养 基中进行培养而得到大量载体慢病毒。
ely including gag and pol, often including tat and rev on the same plasmid, and in some
cases the accessory genes vif , vpr, vpu, and nef), 因此，大多数人使用三质粒系统。
列的片段。该区域出现突变则在HIV-1载体 骨髓中稳定地长期表达， Miyoshi等构建VSV-G假构型HIV-I载体，以绿色荧光蛋白（GFP）作为标记基因，将新鲜分离的人脐血CD34
+细胞在无血清及细胞因子培养基中转染5小时，然后植入经亚致死量照射的非肥胖型糖尿病/重度联合免疫缺陷(NOD/SCID)鼠，可在
9
慢病毒在中枢神经系统中的应用
10
1. Introduction
Recombinant viral vectors have been used to study a variety of fundamental issues in developmental neurobiology, as well as pathogenesis and treatments for various neurodegenerative diseases. Lentiviral vectors are valuable tools for neurobiology research owing to their ability to transduce nondividing cells, such as neurons, and to introduce therapeutic or reporter genes into central nervous system (CNS) cells in vivo and in vitro.
自身失活型（SIN）慢病毒载体3’端LTR的U3区 启动子发生失活突变后，在逆转录过程中转移至 5’LTR。这样的载体整合入靶细胞，将不会产生完 整长度的载体RNA，因此命名为“自身失活型载 体”。
研究表明慢病毒核蛋白质前整合复合物具有噬核 特性，病毒基因组运输至细胞核，从而使慢病毒 可以感染和在非有丝分裂细胞中复制。这一特性 是慢病毒成为基因治疗的转移载体。
3
2.HIV-1的基因结构
HIV-1为双链RNA病毒，共有9个基因。
编码 病毒
gag基因编码病毒的核心蛋白，包括基质蛋白、衣壳蛋 白、核衣壳蛋白。
Poly-D-lysine.
Lentiviral vectors are valuable tools for neurobiology research owing to their ability to transduce nondividing cells, such as neurons,
3.4自身失活型（SIN）慢病毒载体 and to introduce therapeutic or reporter genes into central nervous system (CNS) cells in vivo and in vitro.
showed that efficient and long-lasting gene expression could be obtained in the retina (Fig.
Currently, lentivirus and adenoassociated virus vectors are being used for studying and correcting gene therapy of retinal
5
3.2第二代HIV-1来源的慢病毒载体
1997年,Zufferey等将包装质粒上的vif、 vpr、vpu和nef基因(即辅助基因)敲除,从而
得到的,其他方面与第一代载体系统一致。
6
3.3第三代HIV-1来源的慢病毒载体 为减少复制型病毒的产生，可通过减少辅助质 粒与载体质粒的同源性，或者将gag/ pol和rev编 码序列隔离,分散在不同的质粒上。这样的包装系 统由四质粒代替原有的三质粒包装系统。
慢病毒整合前复合物与核孔相互作用进入细胞 核分裂的细胞，其中的前病毒DNA整合到宿主细 胞的基因组DNA并进行主动运输。此功能是为什 么慢病毒在有丝分裂后的细胞在中枢神经系统的 基因转移载体的主要原因。
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Self-inactivating (SIN) vectors reduce the probability of oncogenesis by pro-moter insertion. In SIN vectors, viral promoter activity is deleted from the inte-grated provirus by deletions in the U3 region of the 3’ long terminal repeat (LTR) that are copied during reverse transcription to the 5’LTR.
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Reagents for calcium phosphate transfection.
Polybrene, 800 μg/mL stock solution in PBS. tat编码的蛋白参与RNA转录的控制。 慢病毒载体系统的另一个特征是携带病毒微粒的表面蛋白，包含HIV受体和共受体，从而改变或扩大的细胞类型的范围，使得该载体可 以结合并且进入。
重组病毒载体已被用于研究各种发育神经生物学 中的基础问题，以及各种神经退行性疾病的发病机 理和治疗。慢病毒载体能转导分裂的细胞，如神经 元，并介导中枢神经系统（CNS）细胞在体内和体 外基因治疗或报道基因而作为神经生物学研究的有 价值的工具。
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1.1. Lentiviral Gene Delivery to
的基 pol基因编码病毒复制所需的酶，如反转录酶、整合酶、
本结 蛋白酶。
构 env基因编码病毒的包膜糖蛋白，决定病毒感染宿主的 靶向性。
调节 rev编码的蛋白调节gag、pol、env的表达水平。
基因 tat编码的蛋白参与RNA转录的控制。
4个辅助基因vif、vpr、vpu、nef编码的蛋白则作为毒力
CNS Cells
Lentivirus preintegration complexes interact with the nuclear pore and undergo active transport into the nucleus of nondividing cells, where the proviral DNA is integrated into the genomic DNA of the host cell. This feature is the primary reason why lentiviruses are being developed as gene-transfer vectors for postmitotic cells in the CNS.
慢病毒
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慢病毒载体概况 HIV-1的基因结构 慢病毒载体历史与构建 重组慢病毒的产生 慢病毒在中枢神经系统中的应用 慢病毒在造血干细胞系统中的应用 慢病毒在眼科疾病治疗中的应用
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1.慢病毒载体概况
慢病毒是逆转录病毒科亚科之一，分为灵长类和 非灵长类慢病毒。灵长类慢病毒包括HIV-1，HIV2，猴免疫缺陷病毒（SIV），非灵长类慢病毒包 括猫免疫缺陷病毒（FIV），牛免疫缺陷病毒 （BIV），马免疫缺陷病毒（EIAV）等，其中HIV 研究最为透彻。
的启动子和增强子序列而无法复制出完整 repeat (LTR) that are copied during reverse transcription to the 5’LTR.
Titering Lentiviral Vectors 滴定慢病毒载体
长度的病毒基因组。 Self-inactivating (SIN) vectors reduce the probability of oncogenesis by pro-moter insertion.
转录后，其5’LTR会因为缺失HIV-1所需要 受鼠脾脏、骨髓及外周血GFP的长期表达。
此外，基因表达被限制在感光体细胞中，是更有效的视紫红质子。
In SIN vectors, viral promoter activity is deleted from the inte-grated provirus by deletions in the U3 region of the 3’ long terminal
and co-receptors, thus changing or expanding the range of cell types that the vector can bind to and enter.
Using an HIV vector carrying the green fluorescent protein (GFP) gene expressed from the cytomegalovirus (CMV) promoter, we
除了病毒3’端LTR的U3区增强子和启动子序 Collection and Concentration of the Viral Supernatant
收集和集中的病毒上清
研究表明，VSV-G假构型HIV-I载体可不经过对HSC的预刺激就能有效地将基因转移到人早期干细胞并能在重度联合免疫缺陷(SCID)鼠
SIN载体的构建是在原病毒载体基础上删 This is done by pseudotyping, which involves replacing the HIV-1 envelope glycoprotein with an envelope glycoprotein from another
virus, such as the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G).
因子参与宿主细胞的识别和感染。两端为长末端重复序 列(LTR)，内含复制所需的顺式作用元件。
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3.慢病毒载体历史与构建
3.1第一代HIV-1来源的慢病毒载体 以Naldini及Kafri构建的三质粒系统为代表，该系统由包 装质粒、包膜质粒及载体质粒3种质粒组成。 包装质粒是HIV-1前病毒基因组5’端LTR由巨细胞病毒早期 启动子取代，3’LTR由SV40 polyA序列取代。包装成分分 别构建在两个质粒上，一个表达gag和pol，另一个表达 env。 载体质粒携带了5’端LTR，和全部5’端非翻译区域，另外 还带有rev应答元件（RRE）。 包膜表达质粒使用水疱性口炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G) 用来代替了原病毒的env基因。
Vitrectomy for the Large Eye 大眼睛的玻璃体手术治疗
Another feature of the lentiviral vector system is that the virions can carry a surface protein that bypasses the usual HIV receptors
degenerative diseases.
目的基因转移HSC后，可随着HSC的自我更新和分化在体内长期表达，因此HSC是较理想的基因转移靶细胞。
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4.重组慢病毒的产生
常用瞬时转染法，即将包膜质粒，包装 质粒和载体质粒共转染人胚肾293T细胞直 接产生生产细胞。最后慢病毒分泌到培养 基中进行培养而得到大量载体慢病毒。
ely including gag and pol, often including tat and rev on the same plasmid, and in some
cases the accessory genes vif , vpr, vpu, and nef), 因此，大多数人使用三质粒系统。
列的片段。该区域出现突变则在HIV-1载体 骨髓中稳定地长期表达， Miyoshi等构建VSV-G假构型HIV-I载体，以绿色荧光蛋白（GFP）作为标记基因，将新鲜分离的人脐血CD34
+细胞在无血清及细胞因子培养基中转染5小时，然后植入经亚致死量照射的非肥胖型糖尿病/重度联合免疫缺陷(NOD/SCID)鼠，可在
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慢病毒在中枢神经系统中的应用
10
1. Introduction
Recombinant viral vectors have been used to study a variety of fundamental issues in developmental neurobiology, as well as pathogenesis and treatments for various neurodegenerative diseases. Lentiviral vectors are valuable tools for neurobiology research owing to their ability to transduce nondividing cells, such as neurons, and to introduce therapeutic or reporter genes into central nervous system (CNS) cells in vivo and in vitro.
自身失活型（SIN）慢病毒载体3’端LTR的U3区 启动子发生失活突变后，在逆转录过程中转移至 5’LTR。这样的载体整合入靶细胞，将不会产生完 整长度的载体RNA，因此命名为“自身失活型载 体”。
研究表明慢病毒核蛋白质前整合复合物具有噬核 特性，病毒基因组运输至细胞核，从而使慢病毒 可以感染和在非有丝分裂细胞中复制。这一特性 是慢病毒成为基因治疗的转移载体。
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2.HIV-1的基因结构
HIV-1为双链RNA病毒，共有9个基因。
编码 病毒
gag基因编码病毒的核心蛋白，包括基质蛋白、衣壳蛋 白、核衣壳蛋白。
Poly-D-lysine.
Lentiviral vectors are valuable tools for neurobiology research owing to their ability to transduce nondividing cells, such as neurons,
3.4自身失活型（SIN）慢病毒载体 and to introduce therapeutic or reporter genes into central nervous system (CNS) cells in vivo and in vitro.
showed that efficient and long-lasting gene expression could be obtained in the retina (Fig.
Currently, lentivirus and adenoassociated virus vectors are being used for studying and correcting gene therapy of retinal
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3.2第二代HIV-1来源的慢病毒载体
1997年,Zufferey等将包装质粒上的vif、 vpr、vpu和nef基因(即辅助基因)敲除,从而
得到的,其他方面与第一代载体系统一致。
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3.3第三代HIV-1来源的慢病毒载体 为减少复制型病毒的产生，可通过减少辅助质 粒与载体质粒的同源性，或者将gag/ pol和rev编 码序列隔离,分散在不同的质粒上。这样的包装系 统由四质粒代替原有的三质粒包装系统。
慢病毒整合前复合物与核孔相互作用进入细胞 核分裂的细胞，其中的前病毒DNA整合到宿主细 胞的基因组DNA并进行主动运输。此功能是为什 么慢病毒在有丝分裂后的细胞在中枢神经系统的 基因转移载体的主要原因。
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Self-inactivating (SIN) vectors reduce the probability of oncogenesis by pro-moter insertion. In SIN vectors, viral promoter activity is deleted from the inte-grated provirus by deletions in the U3 region of the 3’ long terminal repeat (LTR) that are copied during reverse transcription to the 5’LTR.