诊断免疫组织化学阴性对照的标准化:来自国际特设专家委员会的建议

诊断免疫组织化学阴性对照的标准化：来自国际特设专家委员
会的建议
刘勇;杨海玉
【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》
【年(卷),期】2016(032)002
【总页数】2页(P121-122)
【关键词】免疫组织化学;阴性;标准化
【作者】刘勇;杨海玉
【作者单位】江西省人民医院病理科,南昌330006;江西省人民医院临床医学研究所,南昌330006
【正文语种】中文
【中图分类】R446.6
免疫组织化学(简称免疫组化)是应用于临床病理诊断和鉴别诊断的重要技术手段。

免疫组化操作步骤繁多，不同的标本处理方法、不同的抗原修复条件以及不同的检测系统等均可影响染色结果，而设置对照(包括阳性和阴性对照)是检验操作步骤是否正确、染色结果是否可靠的关键。

阳性对照主要用于证实目的抗原是否存在以及评估抗原表达水平，阴性对照主要用于评估免疫组化检测结果的特异性(即排除假阳性结果)。

对照标准化是免疫组化质量控制及其结果判读的主要影响因素，但目前尚未建立统一的标准，在日常病理工作中如何选择应用免疫组化对照是其关键。

最近，国际特设专家委员会对诊断免疫组化阴性对照标准化问题进行了探讨，并且
对诊断免疫组化阴性对照的分类及标准定义、阴性对照结果判读及选择应用等方面提出了专家推荐意见[1]。

本文就该方面内容作一简介。

阴性对照可分为特异性和非特异性两类。

特异性对照是指设计用于检测阳性染色是否为一抗特异性结合反应的对照，包括阴性试剂对照和阴性组织对照，在临床中较为常用。

非特异性对照是指设计用于证实异常阳性染色是否因操作步骤或检测系统问题(除一抗之外)导致的对照。

该类对照通常是在怀疑存在假阳性反应时为进一步分析其原因而设立。

1.1 阴性试剂对照阴性试剂对照是判断阳性结果是否特异的常用对照类型，适用于所有抗体检测。

阴性试剂对照通常选用单张待检患者组织切片，检测时用其他试剂代替一抗或二抗。

根据替换试剂的不同，阴性试剂对照可分为一抗对照和检测系统对照。

一抗对照包括单克隆抗体对照和多克隆抗体对照。

单克隆抗体可选用与被测抗体相同种类、相同Ig亚型及相同浓度的与人体组织无交叉反应的其他单抗作为对照。

多克隆抗体可选用同种动物来源的相同Ig亚型及浓度的正常稀释血清作为对照。

检测系统对照主要是指二抗被正常稀释血清或培养血清或缓冲液代替。

阴性试剂对照的选择主要依据免疫组化检测系统。

如采用的是亲和素-生物素检测系统，则无论何种免疫组化均应设立阴性试剂对照；如采用的是以多聚物为基础的检测系统，则应依据不同情况决定是否设立阴性试剂对照，通常情况下无需设立。

不同的检测条件决定阴性试剂对照的类型和数量。

对于同一病例，每一个检测条件的改变均需设置1张阴性对照片。

例如，针对某一目的抗原设立3种抗原修复条件，则应准备3张阴性对照片。

值得注意的是，在检测时即使应用了有效抗体，也难以完全避免因抗体交叉反应或试剂污染导致的非特异性染色。

因此，仅用阴性试剂对照并不能完全保证结果的特异性，需结合其他对照类型进行综合判断分析。

1.2 阴性组织对照阴性组织对照是指已知的不含有目的抗原的组织/细胞。

广义上细胞株也可用于阴性对照来源，称为阴性细胞对照。

阴性组织对照包括内对照和
外对照。

存在于患者待检组织中的已知不含有目的抗原的组织/细胞称为阴性内对照，而阴性外对照是指非患者待检组织来源的已知不含有目的抗原的组织/细胞。

外对照可来源于归档诊断人体组织(病理蜡块)或移植瘤组织或人造组织，也可来源于细胞株或蛋白肽。

由于外对照组织并非是患者待检组织的一部分，其组织处理条件很难与待检组织保持一致，而内对照在此方面具有明显优势。

专家建议病理医师在判读结果前应仔细寻找可能存在的适宜内对照。

然而，认为存在内对照则不需要另行设置外对照的看法是错误的。

首先，并不是所有检测抗体均有合适的内对照，其次是并非所有患者待检组织中均存在内对照成分，即使存在其提供的信息也非常有限。

外对照可与患者待检组织放置于同一玻片上，也可分开放置于不同玻片上进行检测。

将对照组织和待检组织裱于同一玻片上，可最大程度保证二者检测条件的一致性。

在观察患者待检组织染色结果之前，病理医师和技术员应先判读对照(包括阳性对
照和阴性对照)结果，并且作为免疫组化常规质控记录在案。

通常情况下，免疫组
化检测可仅设立一抗阴性对照，当一抗阴性对照出现阳性反应时，才进一步使用检测系统阴性对照。

如果一抗阴性对照表现为阳性，即认为是假阳性反应，需进一步分析其原因。

如果检测系统阴性对照表现为阳性，则认为可能是由二抗或检测系统其它成分非特异性结合导致的假阳性反应。

如果采用的是亲和素-生物素检测系统，则认为可能是亲和素与内源性生物素结合导致的非特异性染色。

如果阴性试剂对照表现为阴性而阴性组织对照表现为阳性，则认为假阳性反应与一抗异性有关，需排除是否使用了劣质抗体。

美国食品药品管理局(Food and Drug Administration, FDA)根据患者风险将免疫组化检测分为Ⅰ～Ⅲ级。

专家建议不同级别的免疫组化检测应依据适用原则选择阴性对照。

Ⅲ级免疫组化属于高风险检测，在日常病理工作中少见且具有专门制定的工作指导意见，在此就不作叙述。

3.1 Ⅰ级免疫组化Ⅰ级免疫组化主要用于诊断，病理医师将其结果与形态学和
其他相关实验室检查或临床信息结合进行判读。

Ⅰ级免疫组化提供的是辅助诊断信息，其结果通常不作为独立发现报告给临床医师。

当采用新抗体、新检测系统或新抗原修复条件或建立实验室检测方案时，必须设立阴性试剂对照。

以下情况依据病理医师经验决定是否选择使用阴性试剂对照：(1)当组织含有色素，可能干扰免疫
组化染色结果的判断时；(2)当待检组织仅含有肿瘤组织，无其他细胞/组织成分可作为合适的阴性内对照时；(3)最初未设立阴性试剂对照，但怀疑非特异性假阳性
反应存在，应重复检测并设立阴性试剂对照；(4)当一组抗体应用于同一批切片时，如待检组织可提供足够的阴性对照信息，则不需要专门设立阴性试剂对照，反之则应根据需要进行选择。

3.2 Ⅱ级免疫组化Ⅱ级免疫组化主要用于测量目的抗原的表达水平，并且提供
预后相关信息，其结果可作为独立诊断信息报告给临床医师，临床医师依据结果判断患者预后、选择治疗方案或作出其他临床决策。

对于某一特定抗原检测，应遵循已公开发表的指导意见中有关阴性对照的建议；如果指导意见中未涉及阴性对照，则应遵循上述专家推荐意见。

如检测结果用于指导治疗，则每一位患者的每一次检测均应设立阴性试剂对照(如ER、PR、HER-2)。

唯一例外的是，当Ⅱ级免疫组化
同时检测多个抗体时，其中一种抗体检测设立阴性试剂对照即可(例如同时检测ER 和PR)。

应将Ⅱ级免疫组化阴性对照结果列入病理报告中。

值得注意的是，一些Ⅱ级免疫组化检测可仅用于筛查，也可用于指导治疗。

例如检测肺癌中ALK-1表达，如果肺癌ALK-1检测仅仅是筛查目的，则不需要设立阴性试剂对照；如果ALK-1
检测结果用于指导患者治疗，则需要设立阴性试剂对照。

【相关文献】
[1] Torlakovic E E, Francis G, Garratt J, et al. Standardization of negative controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the international ad hoc expert panel[J]. Appl Immunohistochem Mol Morphol, 2014,22(4):241-52.。