项目2微生物发酵技术任务1微生物菌种筛选与保藏

选育方法： 1 自然选育； 2 诱变育种； 3 原生质体技术； 4 杂交育种； 5 分子生物学方法。



第一节 自然选育 自然选育是一种纯种选育的方法，纯化 复状之功效，也可选育正突变株。 一 菌种退化与变异的原因 1 遗传基因型的分离； 2 自发突变的结果； （1）用沙土管长期保藏； （2）菌种连续传代； （3）活细胞内的新陈代谢；
（三）从前突变到突变 经过修复系统后继续保留的突变。 增强诱变效果的方法： 1 抑制修复的酶系统； 2 使诱变的基因处于活性状态。 （四）从突变到突变型 表型延迟： 表型的改变落后的基因型的 改变。 1 分离性延迟； 2 生理性延迟。
二 诱变育种方案的设计 （一）制定筛选目标 高产性状再加辅助目标。 （二）制定筛选方案 1 诱变过程 （1）出发菌株斜面； （2）单孢子悬液制备； （3）孢子计数； （4）单菌落分离。
1.沙土管法

也可将真菌分生孢子用接种环从斜面直 接挑取放入沙土中。然后将沙土管抽真 空干燥。这时管内砂土松散，表明已干 燥。将干燥的砂土管放置在干燥器或密 闭容器内、干燥器下部放置变色硅胶等 干燥剂，于4℃下保存。从斜面取出的孢 子放入沙土管中混匀后，可以不抽真空 直接放干燥器内保存。
1.沙土管法



1 初级代谢产物高产菌株的筛选； （1）降低终产物浓度 ①筛选终产物营养缺陷型； ②筛选细胞膜透性改变的突变株。 (2)筛选抗反馈调节突变株 ①筛选结构类似物抗性突变株； ②利用回复突变筛选抗反馈突变菌株。




2 次级代谢产物高产菌株的筛选 次级代谢产物产生的条件： 共同的前体与营养不平衡。 (1)利用营养缺陷型筛选 芳香族氨基酸与氯霉素有共同的凝胶体莽 草酸，选育芳香族氨基酸缺陷型，有利于积 累氯霉素。 脂肪酸与制霉菌素、四环素、灰黄霉素 有共同的前体丙二酰CoA。 渗漏缺陷型：遗传性障碍不完全的营养 缺陷型。
3. 计划书实施。 计划书要先经过老师的审核，然后 实施。 实施过程中考核操作技能。 实施后及时进行实训报告的撰写也 总结。

决定发酵水平高低的三个因素：生产菌种、 发酵工艺和后提取工艺。其中最重要的是生 产菌种。
选育目的： 1 产生新的生物活性物质； 2 改变产品组分，改进质量； 3 简化生产工艺条件，缩短生产周期； 4 适应新的原材料； 5 提高产量。

在沙土保藏初期，菌死亡率高，以后逐 渐减慢，存活下来的孢子在以后保存期 间稳定性较好，保藏的有效时间与菌种 存活率的关系见图2-10。 用沙 土管保藏的某些抗生素产生菌保藏期可 达 18 年 ( 土霉素和链霉素产生菌 ) 到22 年 ( 新霉素产生菌 ) ，但对利福霉素、卡那 霉素、四环素等容易产生变异的菌种， 就不适合作长期的沙土管保存。
前体：自身不能合成； 自身能合成，但产量低； 自身能合成，但有反馈调节作用。 (8)筛选自身所产的抗生素抗性突变株
第三节 生产菌种的保藏

一、菌种保藏的目的与原理
二、菌种的复壮
一、菌种保藏的目的与原理


(一) 原理 人工创造条件使菌体的代谢 活动处于休眠状态。
菌种保藏

菌种保藏有许多的方法，其共同的目标是 把菌株的优良性状保存下来，防止退化、 死亡或杂菌污染。保藏的一般程序是选取 优良的纯菌种，最好是用其分生孢子或芽 孢等休眠体，在其休眠和停止生长的条件 下保藏。微生物生长要求适宜的温度、水 分、空气和营养物质等，如将菌种处于低 温、干燥、无氧和缺乏营养的条件下，就 可以使菌种暂时处于休眠状态。
项目2：微生物发酵技术
任务1：微生物菌种筛选与保藏
教学安排：
1. 员工培训 由老师讲解理论基础。 分配实操任务(菌种筛选与保藏)。
2. 学生模拟组建运营一个菌种保藏服 务机构，撰写计划书(在理论教学期间完 成 )。 市场部：菌种保藏的适用范围，市场 需求调查，服务推广方案。 技术部：保藏技术的选择、制定相关 技术的操作规程。 品控部：制定菌种保藏质量的标准及 检测方法。 总经理：协调监督各部工作，最后拿 出完整的计划书。
3.大(小)米保藏法

是根据我国制曲原理加以改进的一种 方法。此法是将曲霉等大量产生孢子的 菌直接培养在大(小)米培养基上，待孢 子充分成熟后干燥后保藏。
(五)甘油管保藏法

本法也是利用微生物在甘油中生长和代 谢受到抑制的原理达到保藏目的。其方 法是，将80%的甘油高压蒸汽灭菌待用。 将培养好的斜面菌种用无菌种用无菌水 制成高浓度的菌悬液(108～1010/ml)。取 1ml灭菌甘油放入与甘油充分混匀，使甘 油浓度约为40%，于-20℃下冻存。


（4）DNA中存在增变基因； （5）DNA的代谢失调。 3 经诱变剂处理后的退化变异

二 自然选育的方法
1 单孢子悬浮液的制备； 2 分离及单菌落培养； 3 筛选；
第二节 诱变育种
一 突变诱发过程 （一）诱变剂接触DNA分子前； （二）DNA损伤的修复； 1 光复合修复； 2 切补修复； 3 重组修复； 4 SOS修复系统； 5 DNA多聚酶的校正作用。
1.沙土管法
取河 ( 海 ) 沙，过 0.78mm(24 目 ) 筛，用 10 ％盐 酸浸泡24h，倒去盐酸用清水冲洗至pH呈中性，去 水烘干或晒干。取菜园或果园土粉碎过筛，把烘 干的沙土按3：2或1：1混合装入指形管或高100mm， 直径为10mm的小试管中，高约1cm(约2g)，塞棉塞 121℃灭菌1h，也可用170℃2h干热灭菌(或蒸汽三 次间歇灭菌)，蒸汽灭菌后需烘干。经肉汤检查确 实证明无菌即可使用。将要保存的斜面菌种制成 浓孢子悬液(≥106/ml) ，用灭菌滴管或吸管吸取 孢子悬液滴入无菌沙土上，每管约 0.3 ～ 0.5ml， 用接种环将其混合均匀。
(四)干燥保藏

微生物生长需要水分，干燥法是使菌处 于干燥条件下停止生长及处于休眠状态， 达到较长期保藏的目的。此法用于细菌 芽孢或产分生孢子的菌种，是现在发酵 工业生产中较常用的菌种保藏方法。为 了转接方便，控制接种量以及对菌种的 保护作用，通常将菌种的分生孢子、芽 孢，甚至菌丝体吸附于一些载体表面放 至干燥容器里进行常压干燥或真空干燥， 所用载体有沙土、滤纸、硅胶及大 ( 小 ) 米等。



筛选淀粉酶活性高的突变株。 (5)筛选氨基酸结构类似物抗性突变株 许多抗生素和氨基酸有共同的前体或者 有些氨基酸本身可以作为某些抗生素的前体。 例：半胱氨酸和缬氨酸是青霉素母核。 (6) 筛选二价金属离子抗性突变株 (7) 筛选前体或前体结构类似物抗性突变株 前体或前体结构类似物对菌体生长有抑 制作用。
(二)、菌种保藏
现行的菌种保藏方法有下列诸种:




(一)低温保藏法 (二)低温定期移植法 (三)液体石蜡封存保藏法 (四)固体曲保藏法 (五)甘油管保藏法 (六)真空冷冻干燥法 (七)液氮超低温保存
(一)低温保藏法

这是一种常用的简便方法。一般的斜面孢 子、液态孢子、斜面种子以及用麸皮、大 米、小米或碎玉米制成的孢子，可以放在 4℃冰箱内保藏，这种温度条件下不能使 菌体进入休眠，而仅是抑制微生物的生命 活动。因此，保藏时间不宜过长，一般不 超过1～3个月为宜。本方法虽然简便，但 由于菌株处于较高的水平活性下，这对保 藏株的生产性状是不利的，因此，生产菌 种一般不采用此法保藏。
四
突变株的筛选
(一)随机筛选 1 摇瓶筛选法 优点：培养条件与生产条件相接近； 缺点：工作量大，时间长，操作复杂。 2 琼脂块筛选法 优点：操作简便、速度快； 缺点：固体培养与液体培养差距大，不 能准确反应生产能力。
3 筛选自动化与筛选微型化 （二）理性化筛选 运用遗传学、生物化学的原理，根据 产物已知的或可能的生物合成途径、代 谢调控机制和产物分子结构来进行设计 和采用一些筛选方法，以打破微生物原 有的代谢调控机制，获得能大量形成产 物的高产突变株。
2 筛选过程 （1）传种斜面； （2）留种保藏； （3）筛选高产菌株。
三 突变的诱发 （一）出发菌株的选择 （1）选择纯种； （2）选择具有优良性状的出发菌株；
（3）对诱变剂敏感。 （二）诱变剂的选择 （1）多种诱变剂轮换使用； （2）最适剂量。 （三）影响诱变效果的因素 （1）菌种的生理状态； （2）处理前后的培养条件。



(2)筛选负变株或零变株的回复突变株 (3)筛选去磷酸盐调节突变株 ①筛选能在磷酸盐抑制浓度下，正常产生抗 生素的突变株； ②筛选磷酸盐结构类似物抗性突变株。 低亲和力的磷酸盐转运系统I； 高亲和力的磷酸盐转运系统II。 (4)筛选去碳源分解代谢调节突变株 解除葡萄糖效应(去葡萄糖分解代谢调 节突变株毒性结构类似物抗性突变株)。
(三)液体石蜡低温封存法

具体操作是：菌种为斜面培养菌种，斜 面不宜过长；选择纯净优质石蜡油，置 三角烧瓶中经过 121℃高压蒸汽灭菌 1 ～ 2h，将其放烘箱中(160℃左右)干热处理， 去除灭菌时渗入的水分，待石蜡油变得 清澈透明后冷却即可加入斜面，斜面上 不能出现气泡，液蜡添加量以高出斜面 顶部约1cm左右为宜。
(六)真空冷冻干燥法

冷冻干燥法是在低温下快速将细胞冻结， 然后在真空条件下干燥，使微生物的生 长和酶活动停止。为了防止在冷冻和水 分升华过程中对细胞的损害，要采用保 护剂来制备细甩悬液，使菌在冻结和脱 水过程中起到保护作用的溶质，通过氢 键和离子键对水和细胞所产生的亲和力 来稳定细胞成分的构型。
1.沙土管法

2.滤纸保藏法
本法是将要要保藏的微生物细胞或孢子吸 附在灭菌滤纸上，干燥后冷藏。 是 3# 滤纸剪成 5mm×50mm 的小条，放入干 燥的培养皿中灭菌。将培养好的菌种用灭 菌脱脂乳或奶粉复原乳制成孢子悬液，用 灭菌镊子将准备好的滤纸条在灭菌操作下 浸入菌悬液中，充分吸附菌细胞，取出后 放入灭菌小试管或安瓿管中，在真空干燥 机上抽干，真空条件下火焰熔封，冷藏。
(六)真空冷冻干燥法

真空冷冻干燥保藏法是兼具低温、干燥、 除氧三方面菌种保藏的主要因素，除不 宜于丝状真菌的菌丝体外，对病毒、细 菌、放线菌、酵母及丝状菌孢子等各类 微生物都适用，不宜用冻干法保存的微 生物不到 2% 。冷冻干燥保存的菌种存活 时间长、效果好，一般菌种可保存5年以 上，有的可保藏 15 年以上不发生变异。 还具有体积小、不易污染、便于运输等 优点，是一种用得最为广泛的菌种保藏 方法。
(二)低温定期移植法

斜面定期移植与穿刺移植法有其缺陷， 即容易发生遗传变异；连续传代可使一 些生产性状丢失或减弱，也易于污染杂 菌。因此，一些贵重菌株及生产优良菌 株不宜用此法保藏。
(三)液体石蜡封存法

本方法的原理是在长好的斜面菌上覆盖 灭菌的液体石蜡，达到菌体与空气隔绝， 使菌处于生长和代谢停止状态，同时石 蜡油还防止水分蒸发，在低温下达到较 长期的保藏菌种的目的。保藏温度要求 在-4～4℃下。液体石蜡法适用于不产孢 子的菌种。
菌种保藏 其中低温是保藏菌种的重要因素，也是常用
的一种简单易行的方法。在作低温保藏时，注意 尽量不损伤细胞。在缓慢冷冻时，胞外基质一般 较快结冰而形成冰晶使基质浓度增高，造成细胞 水分外渗而大量脱水，可能使细胞死亡。如快速 降温，胞内也很快形成冰晶，胞内外渗透压基本 平衡，同时胞内冰晶较小，对细胞及原生质膜的 损伤也较小，菌株不易死亡，影响也较小。与低 温相关的保藏方法，如冷冻干燥法、超低温保藏 法等，都是利用低温条件下细胞与环境的特殊平 衡原理而设计的。
(二)低温定期移植法

把培养好的斜面菌种放在低温干燥处保存， 定期移植，一般 3 ～ 6 个月移植一次 ( 视菌 种特征而定 ) 。也可以用穿刺培养，定期 移植法保藏细菌，其效果也较好。穿刺培 养是将含0.6％～0.8％的琼脂培养基装试 管灭菌后直立冷凝后，用接种针尖挑取少 量菌体，垂直刺入琼脂培养基中心，放在 适当温度下培养，待菌长好后即可放低温 保存，此法较斜面保存有利，大肠杆菌可 保藏2年以上不发生明显变异。