滤纸酶活力测定方法

滤纸酶活力测定方法
1试剂
(1)1 M柠檬酸缓冲液：
称取柠檬酸（C6H8O7·H2O）210 g，加蒸馏水750 mL，再加氢氧化钠78 g，充分溶解并冷却后测pH值约为4.2，最后补水定容至1000 mL，得到1 mol/L的柠檬酸缓冲液，其pH值约为4.45。

(2)0.05 M柠檬酸缓冲液：
将1 M的柠檬酸缓冲液稀释20倍即可。

量取1 M的柠檬酸缓冲液50 mL，加水定容至1000 mL，得到0.05 mol/L的柠檬酸缓冲液，其pH值为4.8。

(3)10 mg/mL标准葡萄糖母液（pH 4.8）：
精确称量1.000 g无水葡萄糖（分析纯），或1.1009 g一水合葡萄糖（分析纯），用0.05 M的柠檬缓冲溶液（pH 4.8）定容至100 mL。

得到10 mg/mL、pH 4.8的标准葡萄糖溶液，分装小试剂瓶，置于–20 ℃冰冻保存。

用时按一定比例稀释成不同的浓度系列。

2葡萄糖标准曲线
(1)将10 mg/mL的标准葡萄糖溶液用0.05 M的柠檬酸缓冲液稀释成一系列浓度
梯度的糖液，分别为：0.20、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.60 mg/mL。

(2)上述不同浓度的糖液各取1.5 mL，置于已编号的10 mL具塞刻度试管中，空
白对照为1.5 mL的0.05 M的柠檬酸缓冲液。

(3)每管中均加入2 mL DNS试剂并混匀，在沸水浴中保温5 min（注意：水沸腾
时开始计时），迅速冷却，加水稀释至10 mL并充分摇匀。

(4)利用分光光度仪在540 nm波长下测定各管的吸光值，用空白管调零点。

(5)以吸光值为横坐标，葡萄糖含量（mg）为纵坐标，绘制标准曲线，并拟合回
归方程：Y=A+B*X。

3测定步骤
(1)在10 mL具塞刻度试管中，放入50 mg的Whatman No. 1滤纸条（1×6 cm），
注意要先将滤纸条卷起并折叠。

(2)将待测定的酶液适当稀释，用微量进样器精确吸取50 l，小心地置于滤纸卷
上；再加入1.45 mL的柠檬酸缓冲液（0.05 M，pH 4.8），将滤纸条充分浸没。

整个反应体系的总体积为1.5 mL。

(3)盖紧塞子，在往复式水浴恒温振荡器中，于50 ℃、80次/分的条件下反应
30 min（预热3 min）。

(4)立即往刻度试管中加入2 mL的DNS试剂，在沸水中保温5 min（水沸时开
始计时），冷却后加水稀释至10 mL，充分摇匀。

(5)空白对照用50 μl已灭活的酶液代替，其余步骤同前。

或者先不加酶液，加
完DNS并煮沸后再加入50 μl酶液，稀释至10 mL后作为空白对照。

(6)用空白调零，在540 nm下测定样液的吸光值，根据回归方程得出葡萄糖含
量，并计算滤纸酶活力。

(7)一个滤纸酶活力国际单位（FPIU）定义为：酶水解反应中每分钟生成1.0 μmol
葡萄糖（以还原糖表示）的酶量。

按下式计算：。