三种核酸共提取试剂盒对血液病毒提取效能的比较研究

三种核酸共提取试剂盒对血液病毒提取效能的比较研究
王聪;陈之遥;武海萍;周国华
【摘要】目的比较不同核酸共提取试剂盒对血液病毒的提取效能差异.方法选择国内外广泛使用的3种血液病毒核酸共提取试剂盒,分别为OMEGA试剂盒、QIAGEN试剂盒和WATSON试剂盒,HBV阳性、HBV阴性、HCV阳性和HCV 阴性血清样本均取自南京军区南京总医院.样本核酸提取按照各试剂盒说明书进行操作,定量方法采用实时荧光定量PCR.结果 OMEGA试剂盒对DNA的提取效率最高,对RNA的提取效率最低,耗时最短,成本居中;QIAGEN试剂盒DNA和RNA提取效率均较高,耗时居中,成本最高;国产WATSON试剂盒对DNA或RNA提取效率居中,耗时最长,成本最低.结论不同试剂盒对血液病毒的提取效能各不相同.对于已知病毒载量和病毒种类的样本,根据提取液DNA浓度和RNA浓度选择试剂盒;而对于未知病毒载量和病毒种类的样本,首选QIAGEN试剂盒,其次可选WATSON试剂盒.如只考虑成本,则首选WATSON试剂盒.%Objective To compare the efficiency of different nucleic acid extraction kits for extracting blood virus.Methods 3 commonly used kits for extraction of blood viral nucleic acid were chosen from domestic and international markets, including OMEGA kit, QIAGEN kit and WATSON kit, and serum samples with or without Hepatitis B virus (HBV) and serum samples with or without hepatitis C virus (HCV) were selected from General Hospital of Nanjing Military Area Command. The nucleic acid extraction procedures were carried out according to the instructions of the 3 kits and the real-time quantitative PCR was performed for quantitative analysis. Results OMEGA kit had the best extraction efficiency of DNA but had the worst extraction
efficiency for RNA extraction within a short time and at medium cost. QIAGEN kit had good efficiency for both DNA and RNA extraction with medium term, but at the highest cost; WATSON kit had medium efficiency rate for both DNA and RNA extraction with long term extraction and at the lowest cost. Conclusion There are different efficiency rates at the in extracting blood virus with different nucleic acid extraction kits. We should choose kits for the samples with clear virus capacity and category according to the concentrations of extracted DNA and RNA, but for the samples with unknown capacity and category of virus, QIAGEN kit should be the first priority and followed by WATSON kit. WATSON kit should be the first choice in terms of cost.
【期刊名称】《临床误诊误治》
【年(卷),期】2011(024)008
【总页数】4页(P6-9)
【关键词】病毒核酸提取试剂盒;实时荧光定量聚合酶链反应;提取效率
【作者】王聪;陈之遥;武海萍;周国华
【作者单位】210009,南京,中国药科大学生命科学技术学院;210002,南京,华东医学生物技术研究所;210002,南京,华东医学生物技术研究所;210002,南京,华东医学生物技术研究所;210009,南京,中国药科大学生命科学技术学院;210002,南京,华东医学生物技术研究所
【正文语种】中文
【中图分类】R457.11
随着检测技术的不断进步，输血传播相关病毒的危险性已大大降低，但由于病毒感染者“窗口期”献血、病毒变异、低载量病毒感染等因素，使得临床输血依然存在一定风险。

核酸扩增技术(NAT)直接检测病毒核酸，可大大缩短检测的窗口期，国内外现已广泛用来进行血液安全性筛查［1-2］。

检测血液病毒核酸的常用方法是实时荧光定量PCR技术［3］，其定量性能主要取决于样本核酸的提取效率、引物的序列以及扩增反应的条件［4］，其中样本核酸的提取主要由商品化的试剂盒完成，故已报道的实验研究大都集中在后两个因素。

我们发现不同试剂盒对样本结果的定量性能有较大影响，所以研究不同核酸提取试剂盒的提取效率至关重要。

目前商品化病毒核酸提取试剂盒已经逐步取代传统手工方法［5］。

病毒DNA和RNA提取试剂盒种类繁多，但只能提取单一种类核酸，而病毒检测的对象往往是多种病毒核酸，所以近年开发出的病毒核酸共提取试剂盒应用越来越广泛。

然而不同的核酸共提取试剂盒提取效能和操作有较大差异，且因实验目的和条件的不同，选择的试剂盒也不尽相同。

本研究选取了国内外广泛使用的3种血液病毒核酸共提取试剂盒，以HBV和HCV病毒样本为研究对象，系统地考察了提取效率、操作时间、使用成本等因素，以期为血液安全检测寻找更精确、高效的试剂盒提供依据。

1 材料与方法
1.1 样本来源 HBV阳性、HBV阴性、HCV阳性和HCV阴性血清样本均由南京军区南京总医院血液中心提供。

1.2 试剂及仪器 QIAamp Min Elute Virus Spin Kit购自QIAGEN公司(QIAGEN 试剂盒)，E．Z．N．A．Micro-Elute Viral DNA/RNA Kit购自OMEGA公司(OMEGA试剂盒)，柱离心式小量病毒核酸抽提试剂盒购自上海华舜(WATSON)生
物技术有限公司(WATSON试剂盒)。

无水乙醇、异丙醇购自南京化学试剂
厂;SYBR Premix Ex Taq购自TaKaRa公司;HCV核酸扩增荧光定量检测试剂盒购自深圳匹基生物工程有限公司。

定量扩增检测采用MJ公司的Opticon 2实时荧
光定量PCR仪;HBV-DNA扩增引物由Invitrogen公司合成，序列如下:HBV-FP:5 ＇-GGC AAA TCA GGT AGG AGC GGG AGC-3＇;HBV-RP:5＇-ACTGCCGATTGG TGGAGG CAGGAGG-3＇。

1.3 实验方法
1.3.1 病毒核酸提取方法:①DNA病毒核酸提取:选取4份病毒载量分别在10、103、105、107数量级的HBV阳性样本编号为A、B、C、D，分别采用3种试剂盒提
取其中核酸。

②RNA病毒核酸提取:选取病毒载量分别在103、104、108数量级
的HCV血清阳性样本编号为E、F、G，分别采用3种试剂盒提取其中核酸。

所有操作完全按照试剂盒说明书进行。

1.3.2 实时荧光定量方法:①DNA定量方法:以试剂盒得到的病毒核酸提取液为模板进行实时定量PCR扩增，每份提取液平行测定3次，代入标准曲线计算结果。

所
需反应管数(n)=样本数+1管空白+6管阳性标准品。

20μl实时定量扩增体
系:SYBR Premix Ex Taq 10 μl，HBV-FP 0．4 μl，HBV-RP 0．4 μl，H2O 8．2 μl，模板1 μl。

引物浓度为10 pmol/μl。

运行程序:95℃ 30 s，95℃ 3 s，60℃
30 s，共 40 个循环。

荧光信号收集设在60℃，采用SYBRGREENⅠ荧光染料。

②RNA定量方法:以试剂盒得到的病毒核酸提取液为模板进行实时定量PCR扩增，每份提取液平行测定3次。

所需反应管数(n)=样本数+1管空白+4管阳性标准品。

采用HCV核酸扩增荧光定量检测试剂盒(TaqMan探针法)。

50μl实时定量扩增体系:RT-PCR反应液34．1 μl，RT-PCR 酶0．5 μl，PCR Enhancer 0．4 μl，模
板15 μl。

运行程序:42℃ 30 min，95℃ 3 min，95℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃
60 s，共40个循环。

荧光信号收集设在60℃，TaqMan探针的标记荧光基团为
FAM。

1.3.3 其他性能考察:对3种试剂盒的提取方式、耗时和成本进行比较分析。

1.4 标准曲线测定①DNA病毒核酸标准曲线:定量用对照样本为HBV-DNA的纯化PCR产物，经紫外线法定量测定核酸浓度(拷贝数)，然后稀释成108、107、106、105、104、103、102、10 copies/μl不同浓度的对照用溶液。

结果表明在108～10 copies/μl的定量范围内，标准曲线的线性关系良好(r2＞0．98)。

②RNA病毒核酸标准曲线:定量试剂盒提供的阳性标准品浓度分别为5 ×107、5 ×106、5 ×105、5 ×104 U/ml，结果表明在103～107 U/ml的定量范围内，定量标准曲线线性关系良好(r2＞0．98)。

1.5 相对提取效率计算为能够直观地比较各试剂盒的提取效率，以每个样本提取液中的最高浓度为100%，计算各试剂盒的相对提取效率。

2 结果
2.1 3种试剂盒提取DNA病毒核酸效果比较 3种试剂盒HBV-DNA的实时荧光PCR定量结果存在一定差异，见表1。

通过比较3种试剂盒对HBV-DNA的相对提取效率发现，OMEGA试剂盒的DNA提取效率在前三组样本(A、B、C)中最高;QIAGEN试剂盒在很宽的浓度范围内均具有较高的提取效率，当样本病毒载量较低时，其提取效果比OMEGA试剂盒稍差，但明显高于国产WATSON试剂盒;当样本病毒载量≤103 copies/μl时，WATSON试剂盒已不能进行有效提取，即使样本的病毒载量≥107 copies/μl时，其提取效果也仅有OMEGA试剂盒的
1/10、QIAGEN试剂盒的4%左右，所以WATSON试剂盒有效提取DNA病毒的浓度范围较窄，见图1。

表1 3种核酸共提取试剂盒提取载量不同的HBV样本实时荧光PCR定量结果(copies/μl)样本编号病毒载量QIAGEN试剂盒OMEGA试剂盒WATSON试剂盒A 10 (2．9±0．2)×10 (4．1±0．6)×10 －B 103 (3．6 ±0．3)×103 (6．2
±1．5)×103 (1．7 ±0．1)×103 C 105 (4．0 ±0．4)×105 (4．5
±0．8)×105 (1．3 ±0．2)×105 D 107 (4．6 ±1．2)×107 (1．7
±0．5)×107 (1．8 ±0．4)×106
图1 3种核酸共提取试剂盒对HBV-DNA的相对提取效率比较
2.2 3种试剂盒提取RNA病毒核酸效果比较 3种试剂盒HCV-RNA的实时荧光PCR定量结果不同，见表2。

QIAGEN试剂盒对所有样本均得到较好的提取结果，并且其RNA提取能力在样本病毒载量≤104 copies/μl时远远高于另2种试剂盒;
但对高病毒载量的样本，其提取能力稍低于OMEGA试剂盒。

尽管OMEGA试剂盒对108 copies/μl的样本提取能力最高，但却对病毒载量≤108 copies/μl的样
本不能进行有效提取。

WATSON试剂盒虽然对较高病毒浓度样本的相对提取效率仅为5%，但对3个病毒载量的样本均可有效提取，见图2。

表2 3种核酸共提取试剂盒提取载量不同的HCV样本实时荧光PCR定量结果(copies/μl)样本编号病毒载量QIAGEN试剂盒OMEGA试剂盒WATSON试剂盒E 103 (1．1±0．8)×103 － (0．6±0．8)×102 F 104 (4．8±1．4)×104 －(2．5±4．3)×103 G 108 (0．4±0．1)×108 (1．9±0．2)×108
(0．1±0．1)×108
图2 3种核酸共提取试剂盒对HCV-RNA的相对提取效率比较
2.3 试剂盒其他性能参数比较 3种试剂盒均需要蛋白酶消化，且均采用柱式提取
方式。

起始样本体积均较小(200μl)，但核酸提取液终体积不同，QIAGEN试剂盒20～150 μl，OMEGA 试剂盒15～50 μl，WATSON试剂盒为25～100μl，为定量检测均提供了足够体积的模板量。

在操作耗时方面，虽然QIAGEN试剂盒与OMEGA试剂盒步骤较多，但每个样本的操作时间较短，分别为28min和
27min;WATSON试剂盒操作简单，但每个样本操作时间最长(35 min)。

检测成本参考厂家的报价，QIAGEN试剂盒每个样本使用成本为56元，OMEGA试剂盒为
38元，WATSON试剂盒为15元。

3 讨论
3.1 试剂盒工作原理 3种试剂盒工作原理相似，即先将血液样本与裂解液、蛋白
酶等溶液混合，水浴消化裂解，使病毒核酸释放。

然后将全部溶液转移到吸附柱上，离心去除溶液及杂质，再用溶液洗涤吸附柱2或3次，最后加入洗脱液将柱上的
核酸洗脱下来，即得到含有病毒核酸的提取液。

3.2 提取液核酸浓度差异的原因本研究发现，3种试剂盒提取液的病毒核酸浓度
不同，其原因是多方面的，主要可能是病毒颗粒裂解程度有别，吸附柱与病毒核酸结合、释放能力存在差异，以及洗脱液的洗脱能力不同等。

QIAGEN试剂盒无论
对病毒DNA还是RNA提取能力均较强，且操作时间短，但成本偏高。

OMEGA
试剂盒对病毒DNA的提取效果突出，操作较快，成本居中，但对病毒RNA的提
取效果较差，可有效提取的核酸浓度范围窄。

WATSON试剂盒无论对病毒DNA
还是RNA的提取效率都不如进口试剂盒，操作时间长，但可有效提取的核酸浓度范围较宽，成本也最低。

3.3 选择试剂盒的建议对于已知病毒载量和病毒种类的样本，如果样本中只含有DNA病毒，提取液DNA浓度≤105 copies/μl时，可以采用OMEGA试剂盒;提取液 DNA浓度＞105 copies/μl时，可以采用QIAGEN
试剂盒。

若样本中只含有RNA病毒，提取液RNA浓度≤108 copies/μl时，可采用QIAGEN试剂盒;提取液RNA浓度＞108 copies/μl时，可采用OMEGA试剂盒。

如果样本中同时含有DNA病毒和RNA病毒，首选QIAGEN试剂盒，其次是WATSON试剂盒。

对于未知病毒载量和病毒种类的样本，应首选QIAGEN试剂盒，其次可选择WATSON试剂盒。

若只考虑成本，则首选WATSON试剂盒。

随着血液病毒核酸检测需要的日益增加，市场上可供使用的血液病毒核酸提取试剂盒也逐渐增多，使用者应根据样本的实际情况和使用目的，综合考虑操作繁琐程度、检测成本、实验耗时等多方面的因素来合理选择［6］。

本文选取的3种试剂盒虽
然提取原理相似，但在提取效能、检测成本等方面有很大不同，本研究结果以期对选择合适的血液病毒核酸共提取试剂盒起到一定的参考作用［7］。

［参考文献］
【相关文献】
［1］杨忠思，吴玉清，潘海平．核酸扩增技术在血液筛查乙型肝炎病毒中的应用进展［J］．中国输血杂志，2010，23(1):16-18．
［2］任芙蓉，刘长利，吕秋霜，等．病毒核酸检测在献血者血液筛查中的应用［J］．中华检验医学杂志，2004，27(9):596-599．
［3］ Lekanne Deprez RH，Fijnvandraat A C，Ruijter JM，etal．Sensitivity and accuracy of quantitative real-time polymerase chain reaction using SYBR green I depends on cDNA synthesis conditions［J］．Anal Biochem，2002，307(1):63-69．
［4］ Freeman W M，Walker S J，Vrana K E．Quantitative RTPCR:pitfalls and potential ［J］．Biotechniques，1999，26(1):112-122，124-125．
［5］胡兆平，姚萍，王保龙，等．荧光定量PCR技术在血液筛查中的应用及可行性分析［J］．临床输血与检验，2002，4(1):7-9．
［6］ Ribao C，Torrado I，Vilarino M L，et al．Assessment of different commercial RNA-extraction and RT-PCR kits for detection of hepatitis A virus in mussel tissues［J］．J Virol Methods，2004，115(2):177-182．
［7］ Dauphin L A，Moser B D，Bowen M D．Evaluation of five commercial nucleic acid extraction kits for their ability to inactivate Bacillus anthracis spores and comparison of DNA yields from spores and spiked environmental samples［J］．J Microbiol Methods，2009，76(1):30-37．。