itraq相关知识

1）iTRAQ标记
①溶解，定量：取冻存的8组蛋白样品，各加入40ul裂解液和2ul变性剂，振荡混悬溶解，离心去除沉淀。

用Bradford法定量，根据溶液的蛋白浓度进行调整，使每组蛋白样品量为40ug，体积20ul。

②还原，封闭：按试剂盒提供方案进行还原、封闭。

③酶解：向各组蛋白溶液中加入1ug胰酶，37℃温育16 h。

④标记：将8只标记试剂经50ul异丙酚稀释后与对应样品混合(标记试剂113、114、115、116、117、118、119和121分别对应8个样品)，室温放置1 h，各管中加入100ul去离子水使标记物失活，混合8组样品，冻干。

2）肽段分离及鉴定
①第一维强阳离子柱分离：流动相A液含10 mmol／L KH2PO4和25％ACN，pH 2.6；B液含10 mmol／L KH2P04、350mmol／L KCI和25％ACN，pH 2.6。

将冻干样品溶解于80ulA液并全部上样。

设紫外检测波长为214 nm／280nm，流速为200 uL／min。

线性梯度洗脱程序为：5～40 min，5％～25％B；40—45 min，25％～80％B；45—50 min，80％B；50—60 min，0％B。

根据峰形和时间共收取15-20个梯度，真空离心浓缩后，每馏分用50ul反相液相色谱的A相溶解，进样量20ul。

②第二维反相液相色谱：流动相A液为5％(体积分数)乙腈和0.1％甲酸溶液，流动相B液为95％乙腈和
0.1％甲酸溶液。

RPLC柱线性梯度洗脱程序为：0—5 min，上样；5—70 min，5％一35％B；70—75 min，35％～80％B；75～80 min，80％B；80—81 min，80％一5％B；90 min停止。

③质谱鉴定：纳喷雾针直接连接于反相色谱柱末端作为喷雾接口，喷雾电压2.2 kV。

MS扫描范围400～1800u，一个谱图选择4个最强的母离子进行串级扫描，MS／MS扫描范围100—2000u。

所得串级质谱数据wiff文件通过ProteinPilot 3.0软件检索SwissProt数据，根据软件对鉴定到的蛋白质打分，报告阈值为1.3，对应蛋白质的假阳性率为5％。

蛋白质中的itraq有几个很关键的点，你找公司做的时候需要注意，首先是仪器型号，国内最好的应该是Triple TOF 5600 ，能打出蛋白数量最多，其次scx分级，如果你不懂，公司是不会和你讲的，一般公司最多分10级，好的公司分15级，再好一点的公司分20级，15级算是很负责的了，20级的应该不多，因为这个涉及到成本，分级越多，意味着打质谱次数越多，成本成倍的往上涨，当然打出的蛋白就会越多。

如果这些你都不是很懂的话，你就直接问问我上面说的东西，然后再看看数据分析能力，有些说数据分析赠送，这个是个陷阱，到时候数据分析得不好，你需要根据文章reviewer的要求修改，他们是不会帮你修改的，因为这个服务本来就是赠送的，你完全惊呆了。

华大的话，一般接的是大单子，国际上的也有，它主要做测序吧，蛋白这块没听说有多强，蛋白组中心用的好像是4800，仪器老了点。

去百度搜itraq，可以问一下上海biotree生物科技，上海敏芯，敏芯我不清楚，biotree用的好像是香港大学的平台，仪器就是Triple TOF 5600 。

现在最好的一起是ABI 公司的5600和thermo公司的QE，前者扫描速度快，后者分辨率高。

都很强大。

还有分级的话10-15个就可以了他们的扫描速度足够了，太多也没太大区别。

关键还是看服务，是否承诺数据修回等，要写进合同里，
选择公司的话最好问下他们流份的分级情况，一般的分10-15，好的会分15-20，分级分的越多，测出来的蛋白也就越多。

价格，时间什么的还是要问清楚的，我觉的合同规范的话这都不是事儿，还有一点比较重要就是要看他们售后服务是不是很好，特别是做完发文章的时候，出现问题了找他们都没有回复，这样你就哭了~
蛋白质组学中itraq数据一般来说做如下分析的比较多
1.差异蛋白筛选
2.层次聚类分析
3.差异蛋白GO分类
4.差异蛋白pathway分析
5.差异蛋白互作网络构建我也只能简单介绍一下这些数据分析
1.差异蛋白筛选，一般用到的两个值是foldchange值和p值，其中前者是表达量的倍数值，后者是学氏-T 检验值，一般都是运用这个两个值来筛选的，foldchange值大于2或者小于0.5，p小于0.05，都是显著差异。

这个阈值也可以变动，可以根据参考文献，略作调整
2.层次聚类其实就是根据表达量差异做的一个热力图，第一点从样本重现性角度可以看同一组样本中，蛋白表达趋势是否相同，第二点，从蛋白角度看，可以看到哪些蛋白是拥有相同或相近的表达趋势，以便于通过已知蛋白的功能，推测未知蛋白的功能，用itraq检测出来的蛋白比较多，所有一般来说都是用差异蛋白来做的这个图，在文献里也经常可以看到这种类型的图
3.差异蛋白的GO分类，全名Gene Ontology，可分为分子功能（Molecular Function），生物过程（biological process）和细胞组成（cellular component）三个部分。

蛋白质或者基因可以通过ID对应或者序列注释的方法找到与之对应的GO号，而GO号可对于到Term，即功能类别或者细胞定位。

功能富集分析: 功能富集需要有一个参考数据集，通过该项分析可以找出在统计上显著富集的GO Term。

该功能或者定位有可能与研究的目前有关。

GO功能分类是在某一功能层次上统计蛋白或者基因的数目或组成，往往是在GO的第二层次。

此外也有研究都挑选一些Term，而后统计直接对应到该Term的基因或蛋白数。

结果一般以柱状图或者饼图表示。

根据挑选出的差异蛋白，计算这些差异蛋白同GO 分类中某（几）个特定的分支的超几何分布关系，GO 分析会对每个有差异蛋白存在的GO 返回一个p-value，小的p 值表示差异蛋白在该GO 中出现了富集。

4.Pathway分析
根据挑选出的差异蛋白，计算这些差异蛋白同Pathway 的超几何分布关系，Pathway 分析会对每个有差异蛋白存在的pathway 返回一个p-value，小的p 值表示差异基蛋白在该pathway 中出现了富集,也可以使用KEGG数据库，将蛋白和代谢组学的数据进行一起分析，看看两者之间上下游的调控关系。

5.基因网络分析
根据文献，数据库和已知的pathway 寻找蛋白之间的相互关系(不超过1000 个蛋白)，做出来的图可以用不同的线连接各种蛋白，线的种类可以表示其不同的关系，连接度高低可以看出蛋白的重要性，起到提示作用。

进行验证的时候也可以选取其中连接度较高的一些蛋白，做wb之类。

1. itraq的原理是什么？
Itraq的检测可以做这样的比喻，蛋白被打成肽段后，被平均的铺在了一个有384个孔的平板上，然后机器会从每个孔中选取浓度在前5名的蛋白进行鉴定和比对，所以，如果假设每个一个样本中有100个蛋白，他们的浓度均为1%，那么得到的结果就是蛋白的得分低，但是鉴定的蛋白数量会很多，可以达到90以上；如果一个样本中有100个蛋白，有3个蛋白的含量分别为30、20、10、其他的97钟蛋白为剩下的50%，那么这三种蛋白的得分高，但是鉴定出的蛋白数量会比较少，也许只有50或者60个。

因为一些高丰度的蛋白会大量分部在上述的小孔中，抑制了其他蛋白的检出效果。

2.iTRAQ技术区别与以往二维电泳技术，具有如下优势：
2.1灵敏度很高，检测限较低，可检测出低丰度蛋白；
2.2高通量：同时对4-8个样本进行分析，提高实验通量，可同时对多个时间点或不同处理的蛋白质进行分析；
2.3分离能力强，分析范围广，iTRAQ可以对任何类型的蛋白质进行分离鉴定，包括高分子量蛋白质、酸性蛋白和碱性蛋白，膜蛋白和不溶性蛋白；
2.3结果可靠：通过高度敏感性和精确性的串联质谱方法，不需要凝胶，即可获得相对定性与定量分析结果；
2.5自动化程度高：液相与质谱连用，自动化操作，分析速度快，分离效果好。

由此可得，iTRAQ技术比二维电泳技术能发现更多数量和种类的蛋白，但在比较胞浆蛋白及蛋白量的变化方面，二维电泳技术有一定长处，对iTRAQ的实验结果有互补作用。

3. LC/MS中蛋白处理是定量还是定性？
这是属于定量，需在蛋白定量后，各取相同量（50-100ug）的蛋白（体积不大于25ul，少于25ul的用专用裂解液补至25ul）进行还原化和烷基化。

4. LC/MS对需要检测的蛋白有量的要求吗？
有的，要求蛋白量最低50ug，浓度最低要为5ug/uL，否则同位素无法标记。

5. 数据分析中主要看哪些参数？
对于液质联用的数据分析，一般观察的参数为：TotalIon Score C.I. %（可信度）和Tag-80/Tag-0（两样本的比值）。

6. 众多可信度数值中，主要选择哪些进行研究？
一般来说可信度在80%以上的均为可信程度非常高的。

有些蛋白可信度在60%以上的也可以作为参考数据。

7. 可信程度低于80%的数据有意义吗？
可信程度低于此值的，如果有感兴趣的蛋白可以通过ELISA、WB、Q-PCR、液态芯片等技术手段进一步验证，毕竟LC/MS是研究蛋白组学的方法之一，如全面研究还是要综合各种研究方法。

8. 两样本的比值都代表什么？
两样本的比值如果在0.9-1.1之间的，可以认为两样本的含量是一样的，即比值为1：1；而小于0.9或大于1.1均可认为两样本之间的比值是有差异的。

9. 质谱图中显示的是各种蛋白吗？
不是各种蛋白而是蛋白被打碎后的离子图谱，由于质谱法是电场和磁场将运动的离子（带电荷的原子、分子或分子碎片）按它们的质荷比分离后进行检测的方法。

测出的是离子的准确质量，由此来确定离子的化合物组成。

10. 液质联用是不是可以检测所有蛋白？
原则上讲是这样的，如果单个蛋白在所提供的样本中的含量少于100ng可能就检测不出来了，总体上样量为50-100ug，一般每次可以检测出来的蛋白数量从几百到几千都有可能，取决于标本本身的情况。

11.提供的结果除了分析数据外，是不是包括蛋白名称还是蛋白的大致归类？
给出的是蛋白的名称，按照可信度从大到小排列。

12.是否还有每个蛋白的鉴定图谱或者提供蛋白结果分析?
没有每个蛋白的鉴定图谱，图谱是肽段。

13. 蛋白上样量是多少？收集蛋白体积100ul吗？应该大于100ul还是小于100ul？
itraq对蛋白收集体积没有特别要求，只要求浓度至少是5ug/ul的蛋白至少20ul即可。

14.差异蛋白试验的结果包括哪些呢？存在差异的蛋白种类，名称，肽段序列，分子量，pI或者有否其他的什么信息，结果是以什么形式进行报考呢？表格或图片？
差异蛋白试验的结果包括：ProteinName、Species、AccessionNumber、ProteinMW、ProteinPI、TotalIon Score、L/N；结果以表格形式提供。

15.对实验的样品有什么要求？浓度，纯度，是否可以有盐，如果是胞内蛋白需要怎样裂解，或者你们是否可以帮忙处理样品？
若蛋白由您提供给我们，则蛋白浓度要求5ug/ul，体积要求至少50ul，总蛋白量至少100ug；或者您直接提供组织、细胞或菌体给我们，蛋白由我们来抽提，但是您要告知我们蛋白是抽提全蛋白还是膜蛋白还是其他特殊蛋白。

16.检测的蛋白是酶，酶分型较多，是否可将每种酶分型都检测出来？
检测itraq有一个蛋白库，这个库是网上最新公布的世界上研究出来的所有蛋白信息，如果您检测的酶的各种分型此库里都有收录，那么就可以检测出来，如果没有就检测不出来，这个要看世界上对该种酶研究的程度。

17.是否可以提供蛋白序列？
由于检测出的蛋白数量很多，都是成百上千个，itraq机器不可能将检测出的每种蛋白序列都提供给您，这个工作量非常大，而且也不是每一个检测出来的蛋白对您都有意义，一般可以先提供结果，您选择研究有意义的蛋白名称，我们可以提供相应蛋白肽段给您。

18. 若使用itaq检测human血清，需要血清量是多少？
若itraq方法检测血清，则检测前需要对血清进行高峰度蛋白去除，收集低丰度蛋白后进行itraq检测，去
除高峰度蛋白方法是使用相应提纯柱子，此柱子很昂贵。

19. Itraq检测是否需要重复以便使结果具有统计学意义?
不需要，Itraq技术本身的算法，可以认为得到的蛋白之间的比例，并且是可信度高的实验结果是具有统计学意义的，并且在这个基础上可以进行后续的验证。

20. 目前开展该项业务的公司有很多，能否推荐下哪家公司做的比较好？
目前能开展itraq的公司挺多的，个人推荐上海舜百生物做的相对还是不错的。

之前是叫舜田，现在据说服务质量挺好，周期大约1个月左右。

21. 如果打算开展该项试验，需要提供什么样的样品形式？
最好是提供抽提好的蛋白，冻成干粉，然后用干冰快递过来。

组织蛋白抽提不能用含二维电泳的变性剂来裂解蛋白。

如果组织的话，存放到-80度冰箱中，然后用干冰快递过来，上海本地的，也可以将组织用冻存管装好，投入液氮中运过来即可。