猪肺炎支原体生长培养基的筛选

猪肺炎支原体生长培养基的筛选
猪肺炎支原体生长培养基的筛选
李石1，李劼*，周霞*
(新疆石河子大学动物科技学院，石河子市832003)
摘要：为了解猪肺炎支原体的培养特性，筛选出肺炎支原体生长的最适培养基，本实验采用颜色改变单位（CCU)法和PCR方法对猪肺炎支原体在四种常用培养基及
改良KM2培养基中生长情况进行了检测与比较。

结果显示：本实验室改良KM2培养基为最适培养基，10天时颜色改变单位可达108CCU/mL。

关键词：猪肺炎支原体；培养基；筛选
The screening of Mycoplasma hyopneumoniae growth medium
Li Shi,Li Jie*,Zhou Xia*
(College of animal science and technology of shihezi university,Shihezi 832003,China)
Abstract: In order to develop the culture characteristics of Mycoplasma hyopneumoniae, pick out the most suitable medium, the color change unit (CCU) method and PCR method was used to test and compare the culture of swine mycoplasmal pneumonia cell number between four kinds of medium and improved KM2 medium. The results showed that: the improved KM2 medium was the optimum medium, the color change unit is 108CCU/ml after 10 days of culture.
Key words: Mycoplasma hyopneymoniae; medium; screening 猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneymoniae,Mhp）是引起猪支原体肺炎（MPS，又称“喘气病”）的主要病原。

猪肺炎支原体是一种微小的原核生物，无细胞壁，可在人工培养基上生长，形成呈点状露珠样菌落。

但是由于生长速度慢，培养条件
苛刻而难以培养[1], 常因猪鼻支原体的过度生长而被掩盖[2]。

猪肺炎支原体的培养被认为是该病原体检测的黄金标准[3]。

本实验将猪肺炎支原体168株和强毒济南株分别接种于Goodwin 等复合培养基、驴血清培养基、A26培养基、KM2培养基以及改良KM2培养基中进行了培养试验，采用颜色改变单位（CCU)计数法和PCR方法对猪肺炎支原体在5种培养基中
1项目来源：新疆兵团农业科技重大攻关计划课题(2010GG04)
2作者简介：李石（1988-），男，汉族，湖南郴州人，硕士研究生，研究方向：动物传染病的诊断与防治
Tel:158********,E-mail：*******************
3通讯作者：李劼（1965-），女，汉族，副教授，硕士，研究方向：动物传染病的诊断与防治
周霞（1968-），女，教授，博士，研究方向：动物传染病的诊断与防治
的生长繁殖情况进行了检测与比较，以期筛选出Mhp生长最适培养基，为快速、有效地诊断猪支原体肺炎提供参考依据。

1材料及方法
1.1材料
1.1.1实验菌株
猪肺炎支原体168株，从南京天邦生物科技有限公司生产的猪支原体肺炎克隆弱毒活疫苗(支必宁)中分离。

猪肺炎支原体强毒济南株，由新疆畜牧科学院兽医研究所惠赠。

1.1.2培养基
Goodwin等氏复合培养基(简称GW培养基)、A26肉汤培养基(简称A26培养基)和驴血清培养基参考文献[4]配制；KM2培养基购于江苏农科院兽医所；改良KM2培养基由本实验室自己配制(1L：10g/L水解乳蛋白Hank's液400mL；DMEM400mL；无菌猪血清200mL；酵母浸液10mL；青霉素200IU/mL；酚红4g/L；pH调至7.6）。

1.1.3试剂及仪器
10×Buffer、25 mmol/L MgCl2、2.5 mmol/L dNTPs、2.5U
Taq酶(北京诺维森生物科技有限公司)；Marker1、Loding Buffer(广东东盛生物科技有限公司)；PCR仪（TC-512)，电泳仪等。

1.2方法
1.2.1菌株分离与复苏
将冻存的支必宁和强毒济南株，在无菌条件下，分别用3mL灭菌水稀释，按10%的比例分别接入到5种液体培养基中进行菌株分离与复苏培养，每7天传代1次，共传2～3代。

1.2.2颜色改变单位(CCU)计数
将5种液体培养基分别分装于无菌试管中，每管2.7mL，于第一管加入菌液0.3mL，混匀后吸取0.3mL至第二管，依次类推做10倍梯度稀释直到10-8，从最后一管中吸取0.3mL废弃，设各液体培养基做空白对照，每种培养基做两个平行组。

于37℃恒温箱培养，每天观察各培养基的颜色变化，以培养基颜色改变的最末一管作为培养菌液的CCU。

1.2.3 PCR方法检测
参考文献[5]合成1对Mhp ldh 引物，上游引物p1为：5′-CCGTTGAAGCCTT－GCTGTA T-3′，下游引物p2为：5′-CGGTTAGTGTCTCCCGTTATG-3’，扩增片段大小为287bp。

引物由上海生工生物工程有限公司合成。

模板提取：取各最后一管有颜色变化的培养基1mL，14000rpm 离心10min，弃上清，沉淀用1mL无菌TE缓冲液洗涤1～3次，之后用60～100μL TE悬浮，于沸水浴10 min，置冰上冷却后，10000 r/min 离心10 min，取上清作为模板。

PCR体系（25μL）：10×Buffer 3μL，10mM dNTPs 0.6μL，上下引物各1μL，模板4μL，Taq酶0.3μL，补ddH2O至25μL。

设定以下参数进行PCR反应：94℃预变性3min，94℃变性30S，54.6℃退火30S，72℃延伸40S，进行30个循环，72℃再延伸10min，4℃保存。

取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。

2结果与分析
2.1CCU计数结果
表1 培养7天时各培养基CCU结果
Table 1：The results of CCU in different medium after cultured for 7 days
培养基名称Medium name
各稀释单位/Dilution unit
10-110-210-310-410-510-610-710-8空白对照/Blank control A26培养基/A26 medium ＋＋＋－－－－－－驴血清培养基/Donkey
Serum Medium
＋＋＋＋－－－－－GW培养基/GW medium ＋＋＋－－－－－－KM2培养基/KM2 medium ＋＋＋＋＋－－－－
改良KM2培养基/Improved
KM2 medium
＋＋＋＋＋－－－－注：“＋”表示有颜色变化；“－”表示无颜色变化/Note: "+" the color change; "-" no color change 表2 培养10天时各培养基变色情况
Table 1：The results of CCU in different medium after cultured for 10 days
培养基名称 Medium name 各稀释单位/Dilution unit 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 空白对照/Blank control
A 26培养基/A26 medium ＋＋＋＋＋－－－－驴血清培养基/Donkey
Serum Medium ＋
＋
＋
＋
＋－－－－ GW 培养基/GW medium ＋＋＋＋＋＋＋－－ KM 2培养基/KM2 medium ＋＋＋＋＋＋＋－－改良KM 2培养基/Improved
KM2 medium
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
－
注：“＋”表示有颜色变化；“－”表示无颜色变化/Note: "+" the color change; "-" no color change
各培养基两组平行管中的颜色变化情况基本一致，计数结果显示，猪肺炎支原体在改良KM 2培养基中培养效果较好，培养基颜色改变最快，其次是KM 2培养基。

2.2PCR 检测结果
于培养的第10天，用PCR 方法对各种培养液CCU 管进行病原体检测，结果如下图：
图1 10天时各培养基CCU 的PCR 测定结果
Fig 1:The test results of CCU between different medium by PCR
结果显示10天时各培养基CCU 管检测都出现了明显的目的条带，即说明当培养基有颜色变化时表示有猪肺炎支原体的生长。

3讨论猪支原体肺炎之所以长期在世界各国广泛流行而得不到有效控制，原因之一是该病一旦在某地区或某猪场发生，慢性或隐性感染的猪症状不明显甚至没有症状，
M ：DNA 标准600；1：A26培养基（10-5/CCU ）；2：驴血
清培养基（10-5/CCU ）；3：GW 培养基（10-7/CCU ）；
4：KM2培养基（10-7/CCU ）；5：改良KM2培养基（10-8
/CCU ）
M :DNA M arke r600;1:A26 m ed i um (10-5/CC U);2:D on k ey Ser u m M edi u m(10-5/C CU);3:GW m e d i u m (10-7/C C U );4:K M 2 m e d i u m (10-7/C C U );5:I m p r o v e d K M 2 m e d i u m (10-8/C C U )
却长期带菌，成为传染源，进而传染给易感猪群。

造成这一结果的根本原因，则是
猪肺炎支原体很难分离培养，不易做出确诊[6]。

培养的过程中，可观察到培养液的PH变化，大约在2～5天时，PH值降至6.8左右，以酚红作为指示剂时，培养液由红色变为黄色，培养时间越长，PH下降越多，变色越明显，可作为观察有无支原体生长的一种既直观又简便的方法[7]，用CFU 方法测定支原体含量较困难，而CCU计数法可比较直观的测定培养物中的活菌数，结果更具有代表性[8]，因此采用常规CCU法对液体培养基培养菌数进行测定，可以通过最后培养基的颜色变化单位来确定。

有报道称，采用PCR方法不但能够达到和CCU计数相同的目的，还具有检测速度快、重复性强、效率高等优点，能特异地测定培养物中Mhp的核酸浓度从而确定其菌体数量，及时有效确定最佳收获时机，PCR 检测的最低限量约3×10-3μg, 相
当于1000个菌体左右[9]。

而本试验采用PCR检测猪肺炎支原体在五种培养基中生长情况时，没有看到PCR方法有明显准确的计数效果，但是可以判断生长情况的好坏。

因此，在计数效果方面CCU法明显优于PCR法，但在判断生长情况方面PCR 法具有明显的优势。

从培养基的成分分析，血清为主要营养的成分来源，从本研究可知添加猪血清的培养基较添加牛血清和驴血清的培养基更有利于猪肺炎支原体的生长，同时各材料的比例分配对培养效果也有一定的影响。

目前实验室采用的牛心汤和Hartley消化肉汤多为采购牛心自制，从而导致存在营养成分浓度不一、生物污染等许多偏差，因此在进行大规
模培养时，通常不同批次制备的材料应进行小量的培养实验，以确定最佳材料配比，而改良KM2培养基采用成品DMEM代替了牛心汤，很大程度上避免了这些偏差，取代了制备牛心汤繁琐的步骤，从而大大的减少了制备培养基的成本和时间，从本试验结果看，改良KM2培养基与其他培养基相比，制作步骤简单，成本低，培养效果优良，可为大规模猪肺炎支原体的培养提供参考依据。

总之，猪肺炎支原体的分离培养较其他支原体的培养更困难，需要进一步的研究和优化，寻找更好的培养基，为猪支原体肺炎的诊断和疫苗研究提供坚实的基础。

参考文献
[1] 张顺凤，刘奎.猪肺炎支原体的培养和保存[J].生物学杂志，1996，1:29-30.
[2] 王华，张青，王君玮，等.猪支原体肺炎流行病学和诊断技术研究进展[J].动物医学进展，2009，30(9):73-77.
[3] Marina Sibila，Maria Pieters，Thomas Molitor，et al.猪肺炎支原体的诊断[J]. 魏晓锋，李春华，译.国外畜牧学- 猪与禽，2009，29（3）：4-10.
[4] 甘肃农业大学主编.兽医微生物学实验指导[M].北京:农业出版社，1980:108-111.
[5] 薛云，赵战，陈杨，等.多重PCR方法快速检测猪的5种呼吸道病原菌[J].畜牧兽医学报，2009，40(8):1222-1228.
[6] 还红华，邵国青，倪艳秀，等.猪肺炎支原体培养技术研究[J].中国人兽共患病杂志，2001，17(3):70-71.
[7] 陈天寿主编.微生物培养基的制造与应用[M].北京:中国农业出版社，1995:470-482.
[8] 韦艳娜，熊祺琰，刘茂军，等.不同因素对猪肺炎支原体颜色变化单位测定的影响[J].中国兽药杂志，2012，46(8):8-10.
[9] 沈青春，覃青松，王琴，等.PCR方法测定猪肺炎支原体培养物菌数[J].中国预防兽医学报，2006，28(1):55-57.。