盐酸诺氟沙星在奥尼罗非鱼体内的生物利用度研究

盐酸诺氟沙星在奥尼罗非鱼体内的生物利用度研究
陈本亮;张其中;于相满
【摘要】The hybrid tilapia (Oreochromis aureus x 0. Niloticus) were treated with norfloxacin hydrochloride via intravenous injection and oral administration in medicated feed with a single dosage of 10 mg/kg body weight at water temperature of (25 ± 1 )℃ , and the norfloxacin hydrochloride was determined with high performance liquid ehromatography and analyzed by 3P97 practical phannacokinetics software. The pharmacokinetics and bioavailability of norfloxacin hydrochloride in hybrid tilapia were investigated. The results showed that the data of pharmacokinetics for intravenous injection conformed to a three-compartment model. The pharmacokinetic equation was: C1 =
1.441e-0.04t +5.561e-0.146t + 3
2. 68e-4.447t, and the main parameters were t1/2a=4. 759 h, ht1/2β = 17. 244 h, AUC =81. 342 μg · H/mL. The data of phannacokinetics for oral administration in medicated feed conformed to a two-compartment model. The pharmacokinetic equation was: Ct = 0. 219e-0.102(t-0.473) + 0.034e-0.018(t-0.473) -0.253e-6.977(t-0.473), and the main parameters were t1/2kg = 0.099 h, t1/2α = 6. 817 h, t1/2β = 38.411 h, Tmax = 0. 567 h, Cmax = 0.236 μg/mL, AUC =4.001
μg· H/mL. The bioavailability of oral administration in medicated feed was 4.99%. These results confirmed that the bioavailability of norfloxacin hydrochloride in hybrid tilapia was low under the oral administration of medicated feed. Therefore, the medicine was just suitable forthe
prevention and treatmentof intestinal bacterial diseases.%采用高效液相色谱法分别测定静脉注射和混饲口灌奥尼罗非鱼(Oreochromis aureus×O.niloticus)盐酸诺氟沙星后鱼体血液中该药含量变化,用3P97药动学软件分析药动学参数,计算生物利用度.结果表明,在(25±1)℃水温下,以10 mg/kg剂量对奥尼罗非鱼静脉注射和混饲口灌盐酸诺氟沙星,静脉注射药时数据符合无吸收三室开放性模型,动力学方程为:Ct=1.441e-0.04t +5.561e-0.146t+ 32.68e-4.447t,主要动力学参数为:t1/2α=4.759 h、t1/2β=17.244 h、AUC =81.342 μg· h/mL;混饲口灌药时数据符合一级吸收具时滞的二室开放性模型,动力学方程为:Ct=0.219e-0.102(t-0.473)+0.034e-0.118(1-0.473)-0.253e-6.977(t-0.473),主要动力学参数
为:t1/2ka=0.099 h、t1/2α =6.817 h、t1/2β=38.411 h、Tmax =0.567 h、Cmax==0.236 μg/mL、AUC =4.001 μg·h/mL.混饲口灌的生物利用度为4.99%,表明混饲给药下盐酸诺氟沙星在奥尼罗非鱼体内的生物利用度很低,仅适合肠道细菌性疾病防治.
【期刊名称】《淡水渔业》
【年(卷),期】2011(041)003
【总页数】6页(P66-71)
【关键词】奥尼罗非鱼(Oreochromis aureus×O.niloticus);盐酸诺氟沙星;药代动力学;静脉注射;混饲口灌;生物利用度
【作者】陈本亮;张其中;于相满
【作者单位】暨南大学水生生物研究所,热带亚热带水生态工程教育部工程研究中心,广东省高校水体富营养化与赤潮防治重点实验室,广州510632;暨南大学水生生物研究所,热带亚热带水生态工程教育部工程研究中心,广东省高校水体富营养化与
赤潮防治重点实验室,广州510632;暨南大学水生生物研究所,热带亚热带水生态工程教育部工程研究中心,广东省高校水体富营养化与赤潮防治重点实验室,广州510632
【正文语种】中文
【中图分类】S948
诺氟沙星(norfloxacin)又名氟哌酸，属于第三代氟喹诺酮(fluoroquinolones)类药物，其主要抗菌机理是通过作用于细菌DNA拓扑异构酶，干扰细菌DNA合成，从而迅速杀死细菌[1]。

该药具有抗菌谱广、杀菌力强、组织吸收速度快、分布广等优点已被广泛应用于医学及水产病害控制中[2,3]。

为提高诺氟沙星水溶性，方便使用，我国成功开发了盐酸诺氟沙星(Norfloxacin hydrochloride)[4]。

尽管欧盟和美国已禁止将诺氟沙星用于食品动物，但是我国政府并未禁止在水产养殖动物中使用诺氟沙星[5]。

为了科学有效使用诺氟沙星和其衍生物(盐酸诺氟沙星)控制水产疾病，已有文献研究了诺氟沙星在中华鳖(Trionyx sinensis)[6]、鲤(Cyprinus carpio)[7]、牙鲆(Paralichthys olivaceus)[8]、鲈鱼(Dicentrarchus labrax)[9]、鲫(Carassius auratus)[5]、草鱼(Ctenopharyngodon idella)[10]等水产动物体内的药物动力学，以及盐酸诺氟沙星在奥尼罗非鱼(Oreochromis
aureus×O.niloticus)体内的药动和残留消除规律[11]，但未见有关盐酸诺氟沙星在水生动物体内的生物利用度(bioavailability)的研究报道，而生物利用度是指药物吸收进入血液循环的程度和速率，是评价药物及其制剂在某种鱼使用恰当与否的重要指标。

本研究以我国南方大规模饲养的淡水鱼类奥尼罗非鱼为对象，研究了盐酸诺氟沙星在该鱼中的绝对生物利用度，为科学、规范使用该药物治疗奥尼罗非鱼细菌性疾病提供理论依据。

1 材料和方法
1.1 实验用鱼
健康奥尼罗非鱼，体重(500±10) g，由广州市白云区水产研究所提供。

实验前暂
养于室内水泥池一周，用增氧机连续充氧，每天定时定量投喂不含任何药物的鱼用饲料。

实验前3 d 停止投喂饵料，实验在玻璃水族箱(105 cm×50 cm×60 cm)中进行，水温控制在(25±1)℃，pH(6.9±0.1)，持续保持充气状态。

1.2 实验药品和试剂
盐酸诺氟沙星标准品(批号：H060105，纯度=99.5%)购自中国兽医药品监察所；盐酸诺氟沙星原粉(纯度=98%)，由华天动物医药科学技术开发公司提供。

其它试
剂包括乙腈(色谱纯，SIGMA公司)、正己烷(分析纯，天津市大茂化学试剂厂)、
磷酸(分析纯，广州市化学试剂厂)、三乙胺(分析纯，广州市化学试剂厂)、超纯水。

1.3 仪器设备
Agilent1100型高效液相色谱仪、XHF-D高速分散器(宁波新芝生物科技股份有限公司)、Spring R30i+纯水机(锐思捷公司)、79-1型磁力搅拌器(金坛富华仪器公司)、3150E-DTH超声波清洗器(BRANSON公司)、电子微量天平(SARTORIUS
公司)、2-16K型高速冷冻离心机(SIGMA公司)、旋涡混合器(Kylin-Bell公司)、
N-EVAPⅢ吹氮浓缩仪(Organomation公司) 。

1.4 给药方法及样品采集
1.4.1 静脉注射给药及采样
用灭菌生理盐水(浓度为0.9%)配制5 mg/mL的盐酸诺氟沙星溶液。

按10 mg/kg 的剂量[7]对每尾采用背鳍挂牌标记编号的鱼进行尾静脉注射，注射体积为1 mL，针头是否插入尾静脉通过注射前回抽尾静脉血的方法确定。

注射后0.5、2、8、12、24、36、48、72、96、120、144 h从尾静脉取血1 mL，取血后，每尾鱼
放回继续饲养，每个时间点采样5尾，每尾鱼进行连续采血。

所取血液置于1%肝
素钠处理过的具塞离心管中，以6000 r/min离心10 min，弃沉淀，取上层血浆，并做好标记。

样品于-20 ℃冷冻保存，用于药物分析。

同样方法取对照组鱼血样品作对照。

1.4.2 单剂量混饲口灌给药及采样
称取盐酸诺氟沙星原粉250 mg，置于50 mL烧杯中，加入适量预先煮成流体乳
浊状的鱼饲料，搅拌均匀，定容至50 mL。

按10 mg/kg单剂量用塑料软管插入
奥尼罗非鱼胃内口灌给药，然后将奥尼罗非鱼单独放入一个水盆中观察5 min，将反胃回吐药饵者弃去，无回吐者保留试验。

给药后0.5、2、8、12、24、36、48、72、96、120、144 h从尾静脉取血1 mL，每个时间点采样5尾，每尾鱼进行连续采血，血浆分离方法同静脉注射给药。

以不加药物处理的对照组鱼血样为对照。

1.5 样品处理及HPLC测定
准确吸取200 μL已解冻的血浆于10 mL有盖离心管中，加入等体积的磷酸盐缓
冲液(称取氯化钠0.8 g、氯化钾0.02 g、磷酸氢二钠0.29 g、磷酸二氢钾0.02 g，加入超纯水，搅拌均匀,定容到100 mL，用磷酸调pH值为7.4)，漩涡混合1 min。

再加入3 mL的乙腈，漩涡混合器上混合3 min，在4 ℃、10000 r/min离心10 min，吸上清液于另一个10 mL有盖离心管中。

将残渣再加入乙腈2 mL，重复上述混合、离心和取上层清液过程，进行第二次萃取。

合并两次上清液，在40℃恒
温的水浴中，用氮气吹干。

残留物用1 mL流动相溶解，漩涡混合器上混合2 min，再加入1 mL正己烷去脂肪，涡旋5 min，10000 r/min离心10 min，用一次性
注射器吸取上清液，经0.22 μm微孔滤膜过滤后，进行HPLC分析。

色谱条件：Agilent EclipseXDB-C8柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流动相采用体积比为80∶20的磷酸缓冲液(0.05 mol/L，用三乙胺调pH至2.4)与乙腈的混合液，流速为0.8 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为10 μL，荧光检测器：激发波长为278 nm，发射波长为445 nm。

1.6 标准曲线
称取经干燥的盐酸诺氟沙星标准品，配制100 μg/mL的盐酸诺氟沙星储备液。

用流动相将上述储备液依次稀释成20、10、4、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005、0.002、0.001 μg/mL的标准工作溶液，置于4 ℃冰箱中保存备用。

以药物浓度为横坐标，峰面积为纵坐标做标准曲线，求出回归方程及相关系数。

1.7 回收率
取空白血浆200 μL，分别加入盐酸诺氟沙星标准液2 μg/mL、1 μg/mL及0.5
μg/mL浓度各1 mL，按样品处理方法处理，每个浓度重复3次，依标准曲线回
归方程计算盐酸诺氟沙星实测浓度，按公式计算回收率，回收率(%)=(实测药物浓度/添加药物浓度)×100%。

1.8 精密度
取盐酸诺氟沙星标准液2 μg/mL、1 μg/mL及0.5 μg/mL浓度，加入空白血浆中，按样品处理方法处理，分别在1日内的实验初期、实验中期和实验末期进行测定，每个浓度重复3次，计算日内精密度；对上述样品1周内重复测定三次，每次测
3个重复，计算日间精密度。

按照公式进行计算：精密度(%)=(样品浓度的标准偏
差/样品平均浓度值)×100%。

1.9 数据处理
采用3P97药代动力学软件进行模型拟合和参数计算，算出两种给药模式下，奥尼罗非鱼的主要药物代谢动力学参数及药物动力学方程，并按照公式进行生物利用度计算：
F为绝对生物利用度，AUC(po)混饲口灌血药浓度-时间曲线下的面积，AUC(iv)为静脉注射血药浓度-时间曲线下的面积，Dose(po)为混饲口灌药物剂量，Dose(iv)为静脉注射药物剂量。

2 结果
2.1 盐酸诺氟沙星的色谱行为
色谱图中基线走动平稳，盐酸诺氟沙星保留时间为2.65 min左右，与血浆中杂峰分离良好。

2.2 标准曲线和最低检测限
用HPLC测定1.6中设定的各个浓度的标准溶液，得到各个浓度所对应的峰面积。

以浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标作标准曲线，盐酸诺氟沙星在0.001～20 μg/mL浓度范围内线性关系良好，回归方程为：y=336.31x-0.119，相关系数R2=1。

以引起3倍基线噪音的药物浓度为最低检测限，本方法的最低检测限为0.001 μg/mL。

2.3 回收率和精密度
空白血浆中通过添加高、中、低三个不同浓度的盐酸诺氟沙星标准品溶液，测定盐酸诺氟沙星含量。

根据实测浓度和添加浓度计算出盐酸诺氟沙星在血浆中的平均回收率为(88.64±3.22)%，日内精密度和日间精密度分别为1.98%和2.34%，达到了药物代谢动力学研究要求。

2.4 盐酸诺氟沙星在奥尼罗非鱼的药动规律及生物利用度
以10 mg/kg 鱼体重的剂量，盐酸诺氟沙星单次静脉注射和混饲口灌奥尼罗非鱼后，两种给药方式下平均药时曲线见图1和图2。

静脉注射下的盐酸诺氟沙星药动学模型符合无吸收三室开放性模型，其药动学方程为：Ct=1.441e-
0.04t+5.561e- 0.146t +32.68e- 4.447t；而混饲口灌时，药物在0.567 h达到峰浓度，峰浓度为0.236 μg/mL，混饲口灌的药动学模型符合一级吸收具时滞的二室开放性模型，其药动学方程为：Ct=0.219e-0.102(t-0.473) +0.034e-0.018(t-0.473) -0.253e- 6.977(t-0.473)，推算的主要药动学参数见表1。

混饲口灌的生物利用度F=4.99%。

表1 盐酸诺氟沙星在奥尼罗非鱼血液中的主要药动学参数Tab.1 Pharmacokinetic parameters of norfloxacin hydrochloride in plasma of hybrid tilapia (Oreochromis aureus×O.niloticus)参数单位静脉注射混饲口灌Kah- 1-6.977tLh-0.473t1/2pih0.156-
t1/2αh4.7596.817t1/2βh17.22438.411t1/2kah-0.099K12h-
117.2240.028K21h- 13.0460.029K13h- 10.889-K31h- 10.060-K10h-
10.4880.062AUCμg·h/mL81.3424.001CL(s)mg/kg/h/(μg/mL)0.1232.499Tma xh-0.567Cmaxμg/mL-0.236MRTh14.40932.297
注：Ka为药物吸收速率常数；tL为延滞时间；t1/2pi为深室分布半衰期；t1/2α
为分布半衰期；t1/2β为消除半衰期；t1/2ka为吸收半衰期；K12为药物由中央
室到周边室内的一级运转速率常数；K21为药物自周边室到中央室的一级运转速
率常数；K13为药物由中央室到深室的一级运转常数；K31为药物自深室到中央
的一级运转速率常数；K10为药物由中央室消除的一级运转速率常数；AUC为血
药浓度-时间曲线下面积；CL(s)为清除率；Tmax为达峰时间；Cmax为达峰浓度；MRT为药物平均滞留时间。

图1 静脉注射盐酸诺氟沙星后奥尼罗非鱼血浆的平均药时曲线Fig.1 Mean plasma concentrations of norfloxacin hydrochloride against time after intravenous injection of this medicine in hybrid tilapia (Oreochromis aureus×O.niloticus)
图2 混饲口灌盐酸诺氟沙星后奥尼罗非鱼血浆的平均药时曲线Fig.2 Mean plasma concentrations of norfloxacin hydrochloride against time after oral administration of this medicine in medicated feed in hybrid tilapia (Oreochromis aureus×O.niloticus)
3 讨论
3.1 回收率及流动相的选择
回收率是反映实验方法可信度的重要指标之一。

氟喹诺酮类药物结构上既有羧基又有哌嗪环，具有酸碱两性[12]，易溶于酸性或碱性溶液。

目前诺氟沙星提取方法包括用乙腈[13]、甲醇[14]、二氯甲烷[15]等纯有机溶剂，含水的乙腈或甲醇[16]，或有机溶剂添加一定比例的酸或碱等[16,17]提取可提高回收率。

本文采用磷酸盐缓冲液先溶解样品，再加入乙腈提取，并于浓缩后用正己烷脱脂处理可得到澄清透明的样品溶液，提取回收率高达88.64%，满足实验要求。

流动相的pH值对喹诺酮类化合物的保留时间和分离效果有显著影响，本文参照朱泽尧等[11]实验条件，对流动相比例、pH值、流速和柱温等条件进一步调整，流动相采用体积比为80∶20的磷酸缓冲液与乙腈的混合液，提高有机改性剂乙腈的含量，促使盐酸诺氟沙星在色谱柱上更容易洗脱下来，在达到分离度要求情况下快速流出；而用三乙胺将磷酸缓冲液pH值调为2.4，既可以维持流动相的低pH值以抑制硅醇基的解离和保证喹诺酮类化合物在流动相中的稳定溶解状态[17]，还可以避免目标峰出现拖尾现象。

3.2 盐酸诺氟沙星在奥尼罗非鱼体内的代谢模型
在(25±1)℃水温下，以10 mg/kg剂量对奥尼罗非鱼静脉注射和混饲口灌盐酸诺氟沙星，静脉注射途径所得血药浓度-时间方程符合无吸收开放性三室模型，静脉注射模型与环丙沙星静注鲤鱼[18]和土霉素注射给药北极红点鲑(Salvelinus alpinus)[19]、淡水虹鳟(Oncorhynchus mykiss)及海水大鳞大麻哈鱼(Oncorhynchus tshawytscha)[20]中代谢动力学三室模型相同。

而混饲口灌途径所得血药浓度-时间方程符合一级吸收具时滞的开放性二室模型，这与大多数鱼中的盐酸诺氟沙星和诺氟沙星代谢模型相同，如盐酸诺氟沙星水剂口灌和混饲口灌奥尼罗非鱼[11]以及诺氟沙星在鲫鱼[5]、鲈鱼[9]、大黄鱼(Pseudosciaena polyactis)[21]、大菱鲆(Scophthalmus maximus)[22]等鱼体内代谢动力学均为
二室模型。

诺氟沙星在其它鱼体内的药动学研究中，也出现不同的代谢模型，如在鲤鱼[7]单次混饲给药时出现开放性一室模型。

至于最适模型是否与实验鱼种、给药途径等存在关系，暂未有定论。

3.3 温度对药物代谢的影响
温度对药物在鱼体内代谢影响显著，单剂量混饲口灌奥尼罗非鱼盐酸诺氟沙星，在(25±1)℃水温下的吸收半衰期(t1/2ka=0.099 h)、达峰时间(Tmax=0.567 h)和峰浓度(Cmax=0.236 μg/mL)与(20±1)℃水温下的吸收半衰期(t1/2ka=0.428 h)、达峰时间(Tmax=1.63 h)和峰浓度(Cmax=0.099 μg/mL)[11]相比较，水温较高条件下，吸收和达峰时间更快，达峰浓度值更高；吴光红等[23]研究了在17 ℃、23 ℃和29 ℃水温下，恩诺沙星在中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)体内的吸收半衰期(t1/2ka)，结果显示，t1/2ka分别为1.81 h、0.97 h和0.14 h，表明高温条件下药物吸收明显加快；在28 ℃水温下，草鱼口灌磺胺甲噁唑的达峰时间Tmax 要显著短于18 ℃水温下，其峰浓度Cmax显著高于18 ℃下的值[24]。

目前已有研究指出温度每增加1 ℃,药物在鱼体内的代谢速度增加10%[25]，因此在给药时水温是应该考虑的一个重要因素。

在(26±1)℃水温下，以10 mg/kg单剂量口灌诺氟沙星，草鱼吸收半衰期
t1/2ka=0.1827 h，分布半衰期t1/2α=0.5081 h，消除半衰期t1/2β=44.7507 h[10]，此结果与本实验相比，吸收和消除减慢，而分布加快。

因此，在相似水温条件下，同种药物在不同种属的水产动物体内的代谢差异大，因而不可轻易将某药物在某种动物的药动学结果推广到其他动物[26]
3.4 给药方式对药物代谢的影响
本实验静脉注射和混饲口灌盐酸诺氟沙星的分布半衰期t1/2α分别为4.759 h和6.817 h，消除半衰期t1/2β分别为17.224 h和38.411 h，表明静脉注射比混饲口灌的分布和消除都快；在(20±1)℃水温下，以10 mg/kg单剂量水剂口灌和混
饲口灌奥尼罗非鱼盐酸诺氟沙星后，表现为水剂口灌组药物的吸收、分布以及消除都明显快于混饲口灌组[11]；而张雅斌等[7]研究了以10 mg/kg单剂量肌肉注射、水剂口灌和混饲口灌诺氟沙星在鲤鱼体内药物动力学，结果表明肌肉注射的吸收、分布和消除远快于水剂口灌和混饲口灌，水剂口灌比混饲口灌吸收快，浓度高。

因而不同的给药方式会影响药物的吸收、分布和消除。

注射给药，药物可以直接通过血液循环进入体内各组织分布[5]；而混饲给药，药物易与食物中的二价或三价阳
离子结合形成复合物[27]或者药物在经过消化道时，由于各种酶的降解[3]及食物
妨碍药物向肠道壁扩散[18]，导致吸收分布慢，峰浓度低；口灌给药后诺氟沙星会在某些动物体内出现“首过效应”[21]，至于是否会在奥尼罗非鱼体内存在该现象还需进一步验证。

3.5 盐酸诺氟沙星在奥尼罗非鱼体内的生物利用度
生物利用度分为相对生物利用度和绝对生物利用度，相对生物利用度通常指被测制剂与同种药物的其它吸收制剂进行对照，而绝对生物利用度通常指被测制剂与吸收完全的剂型进行对照[28]。

目前研究表明，给药方式、药物种类、鱼种及健康状况等都会对生物利用度产生影响。

在(20±2)℃水温下，水剂口服和混饲口服乳酸环
丙沙星的鲤鱼对该药的生物利用度分别为10.25%和6.22%[18]；而在(17±1)℃水温下，对鲤鱼水剂口灌和混饲口灌诺氟沙星，分析比较药时曲线下的面积，可看出水剂口灌也较混饲口灌的生物利用度大[7]，表明在相同水温下，不同的给药方式
会对生物利用度产生影响。

此外，不同药物在同种鱼体内和同种药物在不同鱼体内的生物利用度均不同，在(10.2±0.2)℃水温下，大西洋鲑(Salmo salar)口服恶喹酸、氟甲喹、沙拉沙星和恩诺沙星等四种喹诺酮类药物后的生物利用度分别为30.1%、44.7%、2.2%和55.5%，表明恩诺沙星被大西洋鲑吸收和利用的程度较其它几种
药物好[29]；而口灌土霉素胶囊在淡水虹鳟及海水大鳞大麻哈鱼的生物利用度不同，分别为24.84%及30.3%[20]。

土霉素混饲口灌健康和染病香鱼(Plecoglossus
altivelis)的生物利用度分别为9.3%和3.8%，表明健康香鱼比染病香鱼的生物利用度要高[30]，因而健康状况也影响药物在鱼体内的生物利用度。

本实验研究结果显示盐酸诺氟沙星在奥尼罗非鱼体内的生物利用度仅为4.99%，比同类药物环丙沙星在鲤鱼体内的生物利用度6.22%[18]还低。

由于盐酸诺氟沙星混饲在奥尼罗非鱼体内的生物利用度低，因此，不适合用于器官系统的细菌性感染治疗，仅仅适合治疗肠道感染。

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