纤维蛋白粘合剂在犬小肠端端吻合术中对吻合口Hyp、VEGF与bFGF含量的影响

纤维蛋白粘合剂在犬小肠端端吻合术中对吻合口Hyp、VEGF
与bFGF含量的影响
年聚盆;陈智华;郭慧琳;范希萍;高宇航;范彩彩;亢心;韩鹏;赵苗苗
【摘要】为探讨纤维蛋白粘合剂(FG)在犬小肠端端吻合术中对吻合口处羟脯氨酸(Hyp)、血管内皮生长因子(VEGF)与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)含量的影响,将30只试验犬随机分为试验组和对照组两组,试验组采用简易缝合配合纤维蛋白粘合剂,对照组采用常规手术肠线缝合;分别于术后第3、5、7、14和28天每组随机选取3只测定吻合口处Hyp、VEGF与bFGF的含量.术后试验组Hyp含量在第5天显著高于对照组(P＜0.05),bFGF的含量在第3天、第5天、第7天显著高于对照组(P＜0.05),VEGF含量在第3天和第5天高于对照组(P＜0.01),在第14天和第28天显著低于对照组(P＜0.01).结果表明,应用简易缝合配合纤维蛋白粘合剂吻合肠管,可促进吻合口处小肠组织内羟脯氨酸、血管内皮因子和碱性成纤维细胞生长因子的分泌,从而加速吻合口的愈合.
【期刊名称】《动物医学进展》
【年(卷),期】2015(036)005
【总页数】4页(P48-51)
【关键词】纤维蛋白粘合剂;小肠端端吻合术;羟脯氨酸;血管内皮生长因子;碱性成纤维细胞生长因子
【作者】年聚盆;陈智华;郭慧琳;范希萍;高宇航;范彩彩;亢心;韩鹏;赵苗苗
【作者单位】甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州730070;甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州730070;甘肃省动物疫病预防控制中心,甘肃兰州730046;甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州730070;甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州730070;甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州730070;甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州730070;甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州730070;甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州730070
【正文语种】中文
【中图分类】S857.12
纤维蛋白粘合剂（fibrin glue，FG）又称生物胶（biological glue），主要成分包括纤维蛋白原、ⅩⅢ因子、抑肽酶、凝血酶和钙离子。

经氯化钠溶解后的纤维蛋白原在凝血酶和被活化的ⅩⅢ因子作用下转变为稳定的纤维蛋白多体，模拟血凝的最后阶段反应产生凝血和止血作用，并参与体内一系列的病理生理过程，如炎症、组织损伤、修复等［1-2］。

近年来FG被应用于不同的外科领域来止血、促进伤口愈合、封闭缺损、防止粘连和作为药物缓释载体等［3-4］。

羟脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）、血管内皮生长因子（vasc ular endothelial growth factor，VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）作为创伤愈合中重要的细胞因子，加快创口胶原沉积，修复损伤组织，加速损伤部位微血管重建，在组织里的含量反映了创伤愈合的速度［5-7］。

为了探讨在小动物临床上的应用价值，本试验将FG应用于犬的小肠端端吻合术中，改进常规肠吻合的方法，以提高肠吻合术后的愈合质量，减少术后并发症。

通过在简单缝合的基础上配合纤维蛋白粘合剂，与常规手术缝合方法进行对比，检测Hyp、VEGF、和bFGF的含量变化，观察FG在犬小肠吻合术中的应用效果，并探讨其促进肠吻合口愈合的作用机制，为兽医临床应用提供理论依据。

1.1 材料
1.1.1 主要试剂猪源纤维蛋白原粉为甘肃农业大学动物医学院临床实验室提取，纯度＞85%；凝血酶原（500IU/mL）为广州白云山医用胶公司生产；抑肽酶（4 500kIU/mg）为上海晨易生物科技有限公司产品；蔗糖为郑州康源化工产品有限
公司产品；氯化钙为天津市大茂化学试剂厂生产；9g/L氯化钠为四川科伦药业股
份有限公司生产（国药准字：H51021157）；陆眠宁Ⅰ（兽药字：2009-070011777）为吉林省华牧动物保健品有限公司生产；红霉素软膏（国药准字
H33020377）为四川美大康华康药业有限公司生产；犬羟脯氨酸、犬血管内皮因子、犬碱性成纤维细胞生长因子ELSA试剂盒均由上海沪鼎生物科技公司生产。

1.1.2 主要仪器分析天平为西安天力仪器厂生产；匀浆机（型号：T10）为广州
仪科实验技术有限公司生产；离心机（型号：TDZ5-WS）为湘仪离心机；移液枪为美国热电公司产品；酶标仪（State Fax-2100）；超净工作台（型号：ZHJH-1112C）为深圳市华弘特净化技术有限公司产品；常规软组织手术器械包。

1.2 方法
1.2.1 动物分组 30只犬均购自兰州市畜禽交易市场，安静饲养1周后未出现任
何疾病，随机分为对照组和试验组，每组各15只，所有犬均饲喂全价犬粮，自由饮水，笼养于通风良好的圈舍内，试验前禁食24h，禁水2h。

1.2.2 手术方法犬全身麻醉，仰卧保定，术部常规备皮，术部切口在脐前腹中线，常规开腹，显露并截断空肠。

采用不同方法行空肠端端吻合术：对照组采用常规缝合，用肠线对两肠管断端行单层间断内翻缝合16针；试验组采用简易缝合配合
FG粘合，具体方法为助手于肠管吻合术前15min，配制FG的A液和B液（A液中含纤维蛋白原188.20 mg、抑肽酶1.33mg、生理盐水1.00mL；B液中含凝血酶原1.00mg、氯化钙9.2g、生理盐水1.00 mL）并用双联注射器分别吸取备用。

用肠线对两肠管断端进行等距离单层间断内翻缝合6针，用平镊捏合固定相邻线
结之间的吻合口，逐段涂布适量FG，捏合10s，完成吻合。

试验组与对照组均需确保吻合口处肠管闭合严密。

清理吻合口与创口后，常规关腹。

犬术后佩戴伊丽莎白圈，禁食12h～24h后开始饲喂流质食物，3d后恢复正常饮食，不限制饮水，安静饲养，青霉素4万单位/kg，肌肉注射，2次/d。

1.2.3 术后观察及样品收集术后密切观察犬的精神状态，饮食和饮水状况，在第3、5、7、14和28天每组各随机选取3只犬，由原切口进腹，仔细观察肠吻合口处与周围组织有无粘连，并截取前后距吻合口0.5cm原吻合段肠，横切等分为3部分，做好标记后分别保存在-70℃冰箱中备用。

1.2.4 bFGF、VEGF和Hyp含量的测定 3种细胞因子的含量测定均按试剂盒说明书进行操作：取含有吻合段的肠管2g，每克加入pH为7.4的PBS 9mL后先匀浆，然后离心得上清液，置于EP管内，在酶标包被板上准确加入50μL标准品，待测样品孔中先加入40μL样品稀释液，然后再加待测10μL样品（样品最终稀释度为5倍），用封板膜封板后放至37℃恒温箱中温育30min，小心揭掉封板膜，倒掉液体，甩干，将洗涤液加满每孔，静置30s后弃去拍干，重复5次，每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外，再进行温育、洗涤，每孔先加入显色剂A50μL，再加入显色剂B50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10min，然后每孔加终止液50μL，终止反应（此时蓝色立转黄色），最后以空白孔调零，选择450nm波长用酶标仪测量各孔的吸光度（OD值），记录所得数据，按照标准品的读数绘制标准曲线，然后计算出细胞因子的含量。

1.2.5 试验数据的统计分析采用SPSS系统统计软件对所有试验数据进行统计学分析，各组间和组内比较用方差分析，所得结果以平均数标准差表示。

样本均数比较采用t检验，当P＜0.05时，差异显著，当P＜0.01时，差异极显著。

2.1 大体观察
术后所有试验犬均成活，在同一时间点试验组与对照组相比，试验组所有犬只肠管
吻合口处均未发生粘连，在同样的饲养条件下均未发生梗阻，而对照组所有犬只肠管吻合口处均有不同程度的粘连，且有1只试验犬在术后28d时发生肠梗阻。

2.2 Hyp、VEGF和bFGF含量的分析
术后试验组羟脯氨酸含量高于对照组（表1），在第5天差异显著（P＜0.05）；血管内皮因子含量在第3天和第5天时试验组显著高于对照组（P＜0.01），第7天时低于对照组，而第14天和第28天时显著低于对照组（P＜0.05）；试验组碱性成纤维细胞生长因子含量在各时间点均高于对照组，在第3天、第5天和第7
天时差异显著（P＜0.05）。

目前，由于自制FG的强度不足，单纯应用FG无法完成肠吻合术，因此本试验中试验组采取简单缝合配合FG粘合的方法进行小肠吻合术，这种方法通过减少缝合针数及缝线数量，并利用FG封闭和止血的作用减少术中和术后吻合口的渗血量，有效降低肠线对吻合口造成的炎性反应，减少吻合口与周围组织的粘连；由于对照组没有使用FG，术后吻合口的渗血导致对照组所有犬只肠管吻合口处均发生了不同程度的粘连，而且缝线缝合不仅造成吻合口处血液循环受阻，使炎症渗出期延长，参与炎症反应的巨噬细胞、T淋巴细胞还通过释放多种介质，刺激成纤维细胞增殖及增强血管内皮细胞的活性，导致瘢痕的过度增生，增加了术后发生梗阻的几率［8］，研究表明，在创伤愈合中应用FG可以减少瘢痕形成［9］，本试验中对照组1只犬在28d时发生肠梗阻，原因可能是由于对照组肠管吻合口处过多缝线加
重了炎性反应，并且影响吻合口处的血液循环，不利于术后吻合口肠管重建，造成瘢痕在吻合口处过度形成，并且该犬本来肠管就较狭窄，进而导致吻合口处狭窄，造成肠梗阻。

羟脯氨酸是胶原的主要成分，其含量与胶原的量呈正相关。

而胶原合成是创伤愈合的关键步骤之一。

本研究中试验组HYP含量整体上高于对照组，且在第5天时Hyp含量显著高于对照组（P＜0.05），说明在各时间点试验组新生胶原的量大于
对照组，这是因为对照组采用单纯肠线缝合，造成吻合口处的炎性反应较试验组严重，而炎性细胞是胶原酶和其他降解酶的主要来源，所以吻合口处的炎症反应不利于胶原的合成，研究表明在肠吻合愈合过程中既存在胶原降解也存在胶原合成，当胶原的合成大于降解则有利于吻合口的愈合［10-11］。

由于试验组中FG的使用，降低了吻合口处的炎性反应，加快了胶原的生成，因此HYP的含量在每一时间点
都高于对照组，而在第5天显著高于对照组可能是因为胶原的合成量远远大于降
解量，更说明了试验组由于使用了FG使整个愈合期缩短并提前。

血管内皮细胞生长因子（VEGF）是与血管再生密切相关的重要细胞因子之一，能
够刺激和调节内皮细胞分裂、增殖，促进新血管的生成，提高微血管的通透性，加快组织细胞与血管内营养物质的交换，对创伤局部组织的修复发挥关键性生物学功能［12-14］。

本试验中VEGF含量在第3天和第5天时试验组显著高于对照组（P＜0.01），第7、14和28天时试验组低于对照组，这是由于试验组应用FG，减少缝线数量，可以加快VEGF因子的合成，术后大量的VEGF可以促进吻合口
加速愈合，随着吻合口的修复，VEGF含量降到了正常水平，所以在术后第7、14和28天时含量又低于对照组，而对照组VEGF含量一直是递增的，说明过多缝线的刺激减少了VEGF的合成，随着时间推移，炎性反应降低，VEGF的合成量缓慢增加，推后了整个愈合的进程，因此VEGF含量水平和吻合口整个愈合进程相一致。

这一结果与潘云松［15］的研究结果相似。

结果表明FG可以促进吻合口组织合成大量的VEGF，促进血管内皮细胞增殖、迁徙和分化，新生大量的微血管，促进吻合口愈合，降低吻合口处的炎性反应，快速修复了吻合口，使吻合口可以在较短的时间恢复到正常水平，而缝线不利于VEGF的合成，导致新生血管的数量较少，吻合口处炎性反应期延长，不利于组织的修复，延长了修复组织的时间。

碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）是一种广泛存在于人体内细胞外间质中的生长
因子，其含量甚微，但对胚胎发育及组织的修复起重要作用，因此bFGF可以作为
反应创伤愈合的细胞因子。

本试验表明：术后各时间点试验组bFGF含量均高于对照组，在第3、5和14天显著高于对照组（P＜0.01），说明术后第3天试验组就已经有大量的成纤维细胞增生，到第14天时增长量相比对照组达到最大，这是由于试验组在使用FG后，可促进bEGF因子的合成，从而进一步加快肠吻合口的愈合速度，对照组的缝线减少了bFGF生成，减缓了吻合口愈合的进程。

章婓然等［16］也做过类似的研究，将bFGF应用在兔回肠吻合，取得了相同的效果。

江涛等［17］把纤维蛋白胶和生长素用于腹腔感染条件下大鼠的肠吻合，也取得了满意的效果。

综上所述，FG应用于肠吻合术，可减少因肠线造成的炎性反应，并通过调节加速成纤维细胞增殖和毛细血管的再生，促进吻合口胶原纤维的生成，通过一系列的改建降低炎性反应造成的破坏，提高吻合口的愈合质量；降低了吻合口狭窄等并发症的发生率，为FG的动物临床应用提供了理论依据。

但目前对于bFGF、VEGF和Hyp在小肠吻合术中变化的机制有待进一步的研究。

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