烟草靶斑病菌(Rhizoctonia solani)粗毒素的生物活性及理化性质

烟草靶斑病菌(Rhizoctonia solani)粗毒素的生物活性及理化
性质
赵艳琴;伏颖;赵秀香;陈建光;孙浩;吴元华
【摘要】To reveal the pathogenic mechanism of tobacco target spot disease (Rhizoctonia solani, R. solani), the toxin of R. solani was isolated and purified, method of determining the biological activity of the toxin and the physical and chemical properties of the toxin were studied. The results showed that the toxin was obtainable by isolation and purification, it could damage detached leaf, inhibit seed germination and radicel growth and cause seedling wilt. Puncturing inoculation on detached leaf was a more suitable method for determining the biological activity of the toxin. The toxin is tolerant to heat and light exposure and relatively storable, it is a polar compound, and its active substance is nonprotein.%为揭示烟草靶斑病菌毒素的致病机理,进行了烟草靶斑病菌毒素的分离、纯化和生物活性测定方法及理化特性研究.结果表明:经分离纯化获得了烟草靶斑病菌的毒素.该毒素可以损伤离体叶片,抑制种子萌发和胚根的生长,并且可致使幼苗萎蔫,离体叶片针刺法最适宜毒素的生活性测定.烟草靶斑病菌毒素具有热与光稳定性,较耐储藏,是一类极性化合物,活性物属非蛋白类物质.
【期刊名称】《烟草科技》
【年(卷),期】2013(000)004
【总页数】4页(P81-84)
【关键词】烟草靶斑病;立枯丝核菌;粗毒素;生物活性
【作者】赵艳琴;伏颖;赵秀香;陈建光;孙浩;吴元华
【作者单位】沈阳农业大学植物保护学院,沈阳市东陵路120号 110866
【正文语种】中文
【中图分类】S432.41
真菌在侵染寄主植物的过程中，毒素是重要的致病因子之一，在非常低的浓度下就可干扰植物正常生理功能，破坏细胞超微结构，从而严重影响植物的代谢。

有关立枯丝核菌毒素，Aoki等［1］和 Vidhyasekaran［2］曾对水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani AG-1-IA）毒素活性成分及致病机理进行了研究；陈夕军等［3］也进行了水稻纹枯病菌（Rhizoctonia.solaniAG-1-IA）毒素的致病机理试验。

而烟草靶斑病（Thanatephorus cucumeris Donk）是由立枯丝核菌（Rhizoctonia. solaniAG-3）引起的烟草叶部病害，1990年Shew等［4］报道了此病害在美国造成了烟草生产的严重损失，1995年谈文［5-6］曾提出我国应该警惕烟草靶斑病，2005年吴元华等［7］在我国首次发现了烟草靶斑病，还进行了病原鉴定和侵染特性试验［8］，并研究了烟草靶斑病菌的遗传多样性［9］和化学防治方法［10-11］。

但有关烟草靶斑病菌毒素研究目前尚未见相关报道。

因此，针对烟草靶斑病菌毒素的配备，生物活性及理化特性的鉴定等进行了试验，旨在进一步揭示烟草靶斑病菌毒素的致病机理。

1 材料与方法
1.1 供试材料
烟草靶斑病菌株YC-9分离于烟草靶斑病典型病斑，经鉴定为立枯丝核菌
(R.solani)；供试烟草品种为NC89。

1.2 毒素的制备及纯化
1.2.1 粗毒素的制备
参考Vidhyasekaran等［2］的方法将供试菌株于PDA平板上培养3 d，取10
块菌饼（5 mm直径）移至100 mL改良Richard培养液中，于25℃恒温培养箱中培养15 d，每隔12 h人工振荡1次。

4℃下3500 r/min离心15 min，取上清液于121℃高压蒸气灭菌15 min，即为粗毒素。

1.2.2 碳吸附柱分离纯化
将上述粗毒素液通过活性炭柱4.0 cm×46.5 cm，颗粒活性炭300 g，流速4.2 mL·min-1；用300 mL甲醇洗脱3次，每次100 mL，将3次甲醇洗脱液于60℃旋转蒸发浓缩至约10 mL，置于真空条件下干燥5~10 h后，进行生物活性测定。

1.3 毒素的生物活性测定方法筛选
参考徐敬友等［12］的方法进行毒素生物活性测定方法筛选，将上述获得的毒素
用100 mL无菌水回溶为毒素原液，分别采用下述方法测定其生物活性。

1.3.1 叶片针刺法
取9叶期烟草叶片，用无菌水洗净后针刺叶片造成伤口，然后取20 μL毒素原液
接种于伤口上，以空白培养液为对照，置于28℃光照培养箱中培养，12~24 h后观察叶片处理部位的病变情况。

1.3.2 种子萌发抑制法
将烟草种子浸在0.5%漂白粉溶液中1~2 min，进行表面消毒后，选取颗粒大小均匀的种子30粒，放在铺有2层灭菌纱布（含10 mL毒素原液）的培养皿里。

置
于25℃下培养7 d，记录发芽数，并计算发芽抑制率。

每处理设3次重复，以空
白培养液为对照。

1.3.3 胚根抑制法
将烟草种子浸在0.5%漂白粉溶液中1～2 min，表面消毒后，置于加有空白培养
液的培养皿内，皿内铺有2层灭菌的纱布，进行催芽，待露白时将种子置于铺有2层纱布的培养皿中，每皿30粒，皿内加入10 mL毒素原液，25℃下培养7 d后，测量种子胚根长度，并计算胚根生长抑制率。

每处理重复3次，以空白培养液为
对照。

1.3.4 幼苗致萎法
将大小一致的烟苗用无菌水洗净根部后，移入盛有2 mL病菌毒素原液的小玻璃瓶中，以空白培养液为对照，重复3次。

置于28℃光照培养箱中观察12~24 h幼
苗发生萎蔫的时间与程度。

1.4 毒素的基本性质测定
上述制备的毒素用5 mL无菌水稀释后，进行理化性质测定。

1.4.1 热稳定性测定
分别将稀释后毒素置于60，80和100℃水浴加热处理30，60，120和180 min；25，4和-20℃储藏30 d。

以稀释后未经温度处理的毒素为对照，采用筛选出的方法进行生物活性测定，每处理3次重复，3 d后观察叶片的症状，测量病斑大小。

1.4.2 光稳定性测定
将稀释后毒素置于自然光照条件下处理5 d，以稀释未经光照处理的毒素为对照，用筛选出的方法进行生物活性的测定，每处理3次重复，3 d后观察叶片的症状，测量病斑大小。

1.4.3 极性测定
分别用等体积不同极性的有机溶剂石油醚、乙酸乙酯、四氯化碳、氯仿、正己烷和甲苯对稀释后的毒素进行萃取，共3次，合并3次萃取液，将得到的萃取相和水
相分别于60℃下减压蒸干，用蒸馏水恢复至原液的体积，并采用筛选出的方法对
各萃取有机相和水相部分进行生物活性测定，以稀释后未经有机溶剂处理的毒素为对照。

1.4.4 蛋白及非蛋白部分的活性
参照罗孟军等［13］的方法进行蛋白及非蛋白部分毒性测定。

将稀释后毒素中加入2倍体积的无水乙醇静置2 h，5000 r/min离心15 min，将蛋白部分用蒸馏水回溶，非蛋白部分于30℃下减压浓缩，蒸发除去乙醇后用蒸馏水稀释至原浓度，以稀释后未经处理的毒素及清水为对照，分别测定清水对照、稀释后毒素、蛋白部分和非蛋白部分的生物活性。

1.5 数据处理
采用Excel 2007和SPSS 17.0进行数据分析。

2 结果与分析
2.1 毒素提取
经恒温培养获得的培养滤液以4.2 mL·min-1的流速经活性炭柱（颗粒活性炭300 g）吸附；并用100 mL甲醇洗脱3次，将3次甲醇洗脱液合并后于60℃旋转蒸发掉甲醇，浓缩至大约10 mL，置于真空条件下干燥5~10 h，获得的毒素物质呈黄褐色、浓稠状液态，见图1-A。

图1 烟草靶斑病菌毒素及其在烟草上的症状表现
2.2 毒素原液的生物活性测定
由图1可知，烟草靶斑病菌毒素能够引起烟草叶片产生坏死斑，初为暗绿色水渍状小斑点，随后病斑逐渐扩大，形成具有同心轮纹并伴有褪绿晕圈病斑，在第3 d 时症状非常明显（图1-B），与烟草靶斑病的田间症状基本一致，而用空白培养液处理的叶片没有出现该症状；毒素原液可以对烟草幼苗产生明显的毒害作用，处理8 h后，烟草幼苗叶片开始下垂萎蔫，24 h后用毒素原液处理的幼苗脱水萎蔫，而用空白培养液处理的幼苗生长正常（图1-C）。

毒素原液对种子萌发和胚根生长
都有明显的抑制作用，经毒素原液处理的种子，萌发抑制率和胚根生长抑制率分别为76.7%和85.2%，均与对照间差异达到极显著水平（P＜0.01）。

测定结果表明，叶片针刺法、种子萌发抑制法、胚根抑制法及幼苗致萎法都可以检测该毒素的生物活性，但叶片针刺法较为简便快捷，因此，选定叶片针刺法为后续试验毒素生物活性检测的方法。

2.3 毒素的理化特性
2.3.1 热稳定性
烟草靶斑病菌毒素分别经60，80和100℃处理30，60，120和180 min后活性均无明显变化，针刺接种叶片后病斑大小为6.62～6.81 mm，均与对照间差异不
显著，表明经高温处理后毒素的活性并没有减弱或消失，该毒素的热稳定性好。

而将毒素置于-20，4，和25℃储藏30 d后，毒素活性也均未发生明显变化，接种
叶片后病斑直径为6.61~6.70 mm，均与对照间差异不显著。

这表明烟草靶斑病
菌毒素在室温或低温下储藏30 d仍保持了很高的活性。

2.3.2 光稳定性
稀释后毒素经过光照5 d后，接种叶片后测定结果表明毒素活性基本没有发生变化，病斑直径为6.65 mm，与未经光照处理的样品无显著差异。

表明该毒素具有
光稳定性，遇光不分解。

2.3.3 极性
极性溶剂萃取处理毒素后，水相均具有生物活性，对照毒素产生的平均病斑直径为6.67 mm，而测试水相的平均病斑直径为6.60～6.85 mm，且与对照相比差异不显著。

萃取处理的各有机相对叶片无致病活性，说明毒素易溶于水，不溶于有机溶剂石油醚、乙酸乙酯、四氯化碳、氯仿、正己烷和甲苯等。

由于水的极性较各有机溶剂强，因此，该毒素属于强极性物质。

2.3.4 蛋白和非蛋白部分毒性测定
经无水乙醇沉淀蛋白后，非蛋白部分对烟草叶片具有明显的致病活性，平均病斑直径为6.58 mm，与稀释毒素接种后平均病斑直径6.72 mm无显著差异，而清水
对照和蛋白部分组分对烟草叶片并无生物活性。

因此，该毒素活性组分为非蛋白物质。

3 小结与讨论
烟草靶斑病菌培养滤液经活性炭吸附、甲醇洗脱、旋转蒸发浓缩，获得了有较强生物活性的毒素。

烟草靶斑病菌毒素可使烟草叶片组织坏死，产生具有同心轮纹并伴有退绿色晕圈的病斑，而Vidhyasekaran［2］和陈夕军［3］等报道的水稻纹枯
病菌毒素也可引起水稻叶片组织坏死的典型纹枯症状，这表明立枯丝核菌毒素在其寄主的致病过程中发挥了重要的作用；烟草靶斑病菌毒素能抑制烟草种子萌发和胚根生长，致使幼苗萎蔫，与陈夕军等［3］和康霄文等［14］发现的水稻纹枯病菌粗毒素显著抑制水稻胚根、胚芽生长，引起幼苗萎蔫的结果基本一致。

另外，由于叶片针刺法较方便，而且可以通过病斑直径的大小进行定量，因此，叶片针刺法可以作为毒素理化特性及生物活性物质测定的追踪方法。

烟草靶斑病菌粗毒素的热稳定性好，100℃处理180 min未丧失毒素的生物活性，室温或低温下储藏30 d后仍保持高的活性；具有光稳定性，耐储藏性；易溶于水，不溶于有机溶剂，是一类强极性物质；非蛋白部分具有很高的活性，而蛋白部分基本无活性，因此该毒素的活性组分为非蛋白类物质。

参考文献
【相关文献】
［1］Aoki H，Sassa T，Tamura T.Phytotoxic metabolites of Rhizoctonia solani
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