211100168_纳米颗粒跟踪技术检测参数的研究

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0 引言
细胞外囊泡（extracellular vesicles ，EVs ）是指从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，主要包括外泌体（exosome ）和微囊泡（microvesicles ）[1]。

大量研究表明，EVs 在各种生理和病理过程中发挥至关重要的作用，肝癌细胞之间的信号转导、间充质干细胞介导的免疫调节和神经元与神经胶质之间的通讯等都有其参与其中
[2-4]。

此外，人造囊泡和脂质体作为药物
递送系统具有巨大潜力[5]。

因此，EVs 、人造囊泡和脂质体等是当前的研究热点之一。

电子显微镜、流式细胞术、蛋白质印迹（Western Blotting ，WB ）和纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis ，NTA ）技术等是细胞外囊泡、脂质体等常用的研究手段。

电子显微镜常用于EVs 和脂质体的形貌、粒径观察；但样品制备过程中的脱水干燥常会导致样本收缩、杯状形态改变
[6, 7]。

流式细胞术不仅能够确定单个
EVs 的细胞来源，还可以检测一个样本中数千个含有多个标记物的EVs ，但是受到流式细胞仪灵敏度和分辨率的限制，在检测小的EVs （例如，外泌体）方面仍存在局限性
[7, 8]。

WB 是常用的蛋白分
析技术，用于检测EVs 相关的目标蛋白，可以提供不同蛋白的大小，但该方法制备处理时间较长[9]。

NTA 技术是一种利用激光散射和布朗运动的特性获得悬浮液中粒子浓度和粒径的方法[10]，常用于检测EVs 、脂质体的粒径和浓度，但对样本中粒子浓度的检测有一定的范围限制。

本研究主要利用NTA 技术对标准样品、外泌体和脂质体进行检测，通过对检测参数进行不同的设置，并分别对检测结果进行统计分析，以更好的了解不同参数对检测结果的影响，便于得出更为准确的结果。

NTA 技术将激光光散射显微镜和电荷耦合器件（CCD ）相机相结合，利用激光散射使溶液内纳米颗粒可视化，并跟踪记录每个纳米颗粒在布朗运动下移动的轨迹，然后根据斯托克斯-爱因斯坦方程计算颗粒的流体动力学半径
[11, 12]。

1 实验材料与方法
1.1 实验仪器
本研究采用马尔文-帕纳科公司出品的Nanosight300（NS300），该仪器采用NTA 技术对悬浮液中10nm-2000nm 范围内颗粒进行粒径、计数、散射光强和荧光检测。

NS300检测流程为：进样→拍摄并记录颗粒布朗运动视频→根据视频分析粒径和浓度，每一步都设置相应的参数。

进样由1mL 注射器进样，分为静态进样和动态进样。

静态进样将样品注射到样品池内，随机选取一个位置停止注射，然后记录60s 位于镜头视野下颗粒的运动轨迹进行分析。

动态进样在微流量注射泵的作用下使样品以一定极慢的速度不间断的通过样品池，同时拍摄记录60s 内经过镜头视野的所有颗粒的运动轨迹进行分析，分析时排除动态进样的速度对布朗运动的影响。

检测粒径为mode 粒径（粒径-浓度曲线分布图的峰值粒径）而非平均粒径。

1.2 实验样本
本研究分别以马尔文-帕纳科公司提供的聚苯乙烯球、通过超速离心提取小鼠结肠癌肿瘤细胞培养基中的外泌体和人工合成的脂质体为检测对象。

1.3 实验方法
1.3.1 聚苯乙烯球浓度的确定
将标准样品分别稀释100、200、400、800、1600、3200倍，以相同的检测参数（speed 、camera level 和threshold ）分别检测不同稀释倍数下的浓度，并绘制浓度标准曲线，从而得出标准样品的浓度。

1.3.2 参数camera level对聚苯乙烯球浓度的影响
camera level 为设置显微镜亮度的参数，在拍摄并记录颗粒运动轨迹前进行设置。

根据浓度标准曲线选择浓度检测准确的稀释倍数，制备聚苯乙烯球的检测样品，并分别以1.3.1中相同的参
数进行检测。

然后在其他参数不变的情况下，使camera level 的值分别增加3和减小3检测同一样本，观察其浓度检测结果的变化，并对每种样品的三组浓度结果进行t 检验。

1.3.3 参数threshold对聚苯乙烯球浓度的影响
Threshold 为是否将颗粒纳入分析的阈值参数，在NS300进行数据分析时设置。

方法同1.3.2制备聚苯乙烯球样品，分别使用同一次记录视频进行多次分析，每次分析改变threshold 值，观察浓度分析结果的变化，并对不同threshold 组间进行t 检验分析。

1.3.4 参数speed对聚苯乙烯球粒径的影响
speed 为设置动态进样时的速度参数，在拍摄并记录颗粒运动轨迹前进行设置。

样品制备方法浓度范围为2.98x107±1.23x106~1.01x109±1.07x108particles/mL 。

当稀释倍数为50时，检测浓度为1.25x109±2.97x108，而根据理论浓度应为2.01x109，可见其浓度偏差较大，如图1。

当浓度过低时，由于每个视野中抓拍的粒子数过少，如图2，样本稀释液中的杂质会对检测结果造成较大影响。

因此NS300适合的检测浓度为1x107-1x109 particles/mL ，而1x108-9x108 particles/mL 为最佳浓度。

图1 聚苯乙烯球浓度标准曲线
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（P<0.05），如表1，图3B 。

speed=25时，检测的浓度在camera level=10和camera level=16之间存在显著差异（P<0.01）；speed=50时，检测的浓度在camera level=10、13和16各组之间均没有显著差异，如表1，图3A 。

表1 不同camera level下粒径和浓度的检测结果
Tab.1 The results of particle size and concentration on
different camera levels
图3 不同camera level对检测粒径和浓度的影响
Fig.3 Effects of different camera levels on particle size
and concentration
ns：没有统计学差异；*：P<0.05；**；P<0.01
2.3 不同threshold值的检测结果
分别对speed=50，稀释200、400、800倍，camera level 取值为13和speed=50，稀释400倍，camera level 取值为10的聚苯乙烯球检测视频进行重新分析，threshold 分别取值为5、10和15。

重新分析后发现，随着threshold 值的变化，当样本浓度发生变化时，粒径也发生相应的改变；当样本浓度变化不大时，粒径的变化也较小，如图4A 、4B 中，当threshold 值增加检测浓度的增加伴随着检测
粒径的减小。

图4 不同threshold对检测粒径和浓度的影响
Fig.4 Effects of different thresholds on particle size and
concentration
图中稀释400倍，camera level 值为10以及稀释200、800倍，camera level 值为13时，threshold 值为10或15重新分析后会使浓度增加同时伴随粒径的减小。

而浓度变化不大时，粒径改变较小。

CL ：camera level ，***：P<0.0001
2.4 不同speed值的检测结果
分别选取speed 值为0、25、50、100、150对稀释400倍的聚苯乙烯球进行检测，camera level 值均为13，threshold 值均为5。

结果发现，随着进样速度的增加，尽管有些组间粒径检测结果不存在统计学差异，但仍有逐渐减小趋势，如图5。

同时，speed 为150时，检测的粒径分布峰出现杂
峰，会影响最终统计结果。

图5 不同speed对检测粒径的影响
Fig5 Effects of different speeds on particle size
图中峰值的数字为粒径的mode 值，NO.1、NO.2和NO.3为样本检测3次的次数。

2.5 2.5speed和threshold对外泌体和脂质体检测结果的影响
将外泌体和脂质体稀释到合适倍数进行检测，当其他参数一致，speed 分别为50、100和150时发现，外泌体和脂质体的检测粒径随speed 的增加呈递减趋势，且speed 为50和150间存在统计学差异（P<0.05），如图6A 。

当检测参数一致，分析参数threshold 分别为5、10和15时，外泌体和脂质体的检测结果一致，即样本浓度增高（P<0.001）伴随着粒径相应变小（P<0.01）；样本浓度变化无统计学意义时伴随着粒径变化也无统计学意义，如图6B 、6C 。

图6 不同参数对外泌体和脂质体检测的影响
Fig.6 Effects of different parameters on the detections
of exosome and liposome
3 结果讨论
外泌体和脂质体在疾病治疗等方面均具有重要的研究意义，因此对其表型特征进行精准研究变得尤为重要。

NTA 是一种从统计方面检测样本浓度和粒径的技术，广泛应用于外泌体和脂质体的研究[13-15]，其各参数对检测结果的影响将会直接影响研究结果。

本研究发现，依托于NTA 技从而可以捕捉到散射光斑更细微的运动，使粒径结果偏小。

但是由于camera level 不同对聚苯乙烯球的检测结果影响不一致，因此没有在外泌体和脂质体中进行验证。

关于该参数的影响仍需要多种样品进行进一步研究。

threshold 是粒子运动轨迹抓拍完成以后进行数据分析时进行调节的参数，主要用来选择纳入分析粒子的阈值。

Maas 等[5]研究发现当threshold 的值越高纳入分析的粒子数越少，检测的浓度越低。

然而我们的研究发现，随着threshold 值增大，浓度增加时伴随粒径的减小，浓度没有统计学差异时粒径也没有。

究其原因，我们发现随着threshold 值增大，软件分析时有将一个粒子划分为多个粒子的现象，因此会使浓度增大，但是粒径减小的原因尚不清楚。

动态进样要比静态进样检测到更多体积的
影响仍需要进行研究。

参考文献
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[3]Borger V, Bremer M, Ferrer-Tur R, et al. M e s e n c h y m a l S t e m/S t r o m a l C e l l-D e r i v e d Extracellular Vesicles and Their Potential as Novel Immunomodulatory Therapeutic Agents[J]. International journal of molecular sciences,2017, 18(7):1450.
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