一株红树林内生真菌次级代谢产物中活性组分的活性跟踪法分离研究

一株红树林内生真菌次级代谢产物中活性组分的活性跟踪法分
离研究
梁小莉;高俊平;潘润恺;佘志刚;肖娜娜;蔡小玲;林永成
【摘要】对从广西山口红树林保护区采集的21株植物内生真菌进行了抗菌、抗肿瘤筛选,得到4株活性菌株,其中SK11菌株活性最强.采取活性跟踪方法,从SK11菌株次级代谢产物中分离到了活性成分Lichexanthone和Bikaverin,并用分子生物学方法鉴定该菌株为链格孢霉菌(Alternaria sp.).这是首次从该属中分离得到这两种化合物.
【期刊名称】《化学与生物工程》
【年(卷),期】2009(026)010
【总页数】5页(P48-52)
【关键词】链格孢霉菌;活性跟踪法;内生真菌;次级代谢产物
【作者】梁小莉;高俊平;潘润恺;佘志刚;肖娜娜;蔡小玲;林永成
【作者单位】中山大学化学与化学工程学院,广东省生物功能分子重点实验室,广东,广州,510275;中山大学化学与化学工程学院,广东省生物功能分子重点实验室,广东,广州,510275;中山大学化学与化学工程学院,广东省生物功能分子重点实验室,广东,广州,510275;中山大学化学与化学工程学院,广东省生物功能分子重点实验室,广东,广州,510275;中山大学化学与化学工程学院,广东省生物功能分子重点实验室,广东,广州,510275;中山大学化学与化学工程学院,广东省生物功能分子重点实验室,广东,
广州,510275;中山大学化学与化学工程学院,广东省生物功能分子重点实验室,广东,广州,510275
【正文语种】中文
【中图分类】Q946.8;Q949.32
海洋共生微生物是指与海洋动植物宿主互利共生的海洋微生物，包括附着在海洋动植物表面(包括内腔)的微生物以及生长在海洋动植物内部(细胞间或细胞内)并与动
植物存在着互惠互利或一方受益的共生或寄生关系的微生物。

近几年, 本研究组已经分离海洋真菌2000多株，活性筛选800多株，鉴定100多株；从已经发酵培养的100多株菌株中，分离次级代谢产物400个化合物，新结
构化合物200多个，初步确定具有抗肿瘤、抗病毒等活性的化合物有140多个,
揭示了海洋真菌具有极大的药用开发前景[1～3]。

2008年3月，本研究组从广西山口红树林保护区采集植物样品和植物根际泥样，分离了共生真菌1430株，通过形态初筛和化学初筛(粗提代谢产物的TLC检测等)，选取有代表性的21株菌进行活性筛选，得到高生物活性的菌株4株，对其中活性最强的红树林内生真菌SK11采用活性跟踪法进行了抗菌、抗肿瘤活性成分研究。

1 实验
1.1 菌株来源
从采集自广西山口红树林自然保护区的1430株菌株中筛选得到21株代谢产物丰
富且特别的菌株。

1.2 试剂与仪器
基因组DNA提取试剂盒(E.Z.N.A. Fungal DNA Kit)、质粒DNA提取纯化试剂盒、PCR产物克隆试剂盒(pGEM-T easy Vector)、PCR产物纯化试剂盒，Omega公
司；胎牛血清、RPMI-1640、0.25%胰蛋白酶，Hyclone公司；MTT ，Sigma公司；抗生素；实验用水均为蒸馏水。

SPX-250 型电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂；SW-CJ-1FD 型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；THZ-C型恒温振荡培养箱，江苏太仓市实验设备厂；移液枪，德国Brand公司；酶联免疫检测仪及高压蒸汽灭菌锅等。

1.3 受试菌株和受试细胞
(1)受试菌株
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, SA)，枯草杆菌(Bacillus subtilis, BS)，大肠杆菌(Escherichia coli, EC)，绿脓杆菌(P. aeruginosa, PA)，八叠球菌(Sarcina ventriculi, Sar.)。

其中SA、BS、EC用硫酸庆大霉素作阳性对照， PA
用氧哌嗪青霉素作阳性对照， Sar.用氨苄青霉素作阳性对照。

(2)受试细胞
乳腺癌细胞株MCF-7，人高转移乳腺癌细胞MDA-MB-435。

1.4 培养基
(1)LB固体培养基(主要用于培养受试菌株)：10 g蛋白胨，5 g 酵母膏，10 g NaCl，1.5%琼脂，加H2O溶解后，调pH值至7.4，定容至1 L，115℃高压灭
菌20 min。

(2)YPD培养基(主要用于真菌发酵培养)：20 g蛋白胨，10 g酵母膏，20 g葡萄糖，50%陈海水，加H2O定容至1 L，115℃高压灭菌，备用。

(3)促孢培养基：KH2PO4 1 g， KNO3 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g， KCl 0.5 g，淀粉0.2 g，葡萄糖0.2 g，蔗糖 0.2 g，琼脂 15 g，水1000 mL。

1.5 方法
1.5.1 内生真菌发酵及代谢产物提取
将21株红树林内生真菌的斜面培养物活化后分别接种至2 L真菌发酵培养基，
28℃、190 r·min-1 摇床培养7～10 d，发酵结束后用4层纱布过滤发酵液，滤
液用等体积的乙酸乙酯(EA)萃取，浓缩3次得粗提物，称重，用二甲基亚砜配成
约20 mg·mL-1 溶液，备用。

1.5.2 内生真菌代谢产物活性检测
采用滤纸片法[4]和MTT法[5]对21株红树林内生真菌粗提物分别进行抗菌、抗肿瘤活性测试。

1.5.3 生物活性复筛及扩大培养
将初筛得到的几株活性好的菌株经过多次传代(5次以上)后，再进行生物活性复筛(重复1.5.2步骤)，选择活性最好且代谢丰富的菌株作为扩大培养活性跟踪分离的
目标，并在优化后的最适培养条件下进行扩大培养(150 L)，培养周期为25 d。

1.5.4 活性菌株的鉴定
分子鉴定[6]：将筛选出来的活性菌株接种于海洋真菌发酵液中，于25℃摇瓶培养
4 d，收集菌丝体。

用真菌基因组提取试剂盒提取基因组，用引物ITS1F(Fungus specific: 5′CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA3′)和ITS4(Universal: 5′ TCCTCCGCTTATTGATATGC 3′)扩增真菌rDNA的间隔序列(含ITS1区、5.8S区、ITS2区)[7]。

PCR反应条件为：94℃变性
5 min，然后按94℃ 30 s→55℃40
s→72℃ 90 s进行30个循环，最后72℃延伸10 min。

PCR产物纯化后，克隆到质粒上转化后送上海生工生物工程技术服务有限公司直接测序。

所得序列在Genebank中用Blast进行相似性分析，用Clustal进行排列比较，同时结合形态特征[8]对活性菌株进行鉴定。

1.5.5 活性组分的提取与分离
1.5.5.1 粗分组分的分离纯化
过滤150 L发酵物得菌体和发酵液，发酵液浓缩后用EA充分萃提[9]。

在EA提取物中拌入适量200～300目硅胶，上柱粗分。

分别用体积比为1∶19、1∶9、1∶4、
3∶7、2∶3、3∶2、4∶1的EA/PE(石油醚)和纯EA淋洗，收集各组分。

按1.5.2步骤进行生物活性测试，选择活性组分再进行分离纯化。

1.5.5.2 活性组分的分离纯化
将上述活性组分提取物拌入适量200～300目硅胶，上柱粗分。

分别用体积比为1∶19、1∶9、1∶4、3∶7、2∶3、3∶2、4∶1的EA/PE(石油醚)和纯EA淋洗，收集各组分再经反复柱层析、制备薄层层析，并结合Sephadex LH-20凝胶柱色谱、半制备反相高压液相色谱等分离方法进行分离，重结晶纯化。

1.5.5.3 生物活性测试及结构鉴定
对分离纯化得到的化合物进行生物活性测试，采用现代波谱技术(NMR、MS),并结合理化性质对其结构进行鉴定。

2 结果与讨论
2.1 21株内生真菌活性筛选(图1、表1)
图1 21株内生真菌发酵物抗肿瘤活性Fig.1 The antitumor activities of the fermenters of 21 strains of endophytic fungi
表1 21株内生真菌发酵物抑菌活性测试Tab.1 The antibacterial activities of the fermenters of 21 strains of endophytic fungi注：“-”表示抑菌圈<10 mm，“+”表示抑菌圈≥10 mm，“++”表示抑菌圈≥15 mm，“+++”表示抑菌圈≥20 mm；括号内为粗提液体积菌种编号
PA(10)PA(20)SA(10)SA(20)EC(10)EC(20)BS(10)BS(20)Sar．(10)Sar．(20)SK1 +++++++++++++++SK2++-
+++++++SK3++++++++++++++SK4++++++++++++++SK5++++++ +++++++SK6+++++++++++++SK7++-+++++++++++SK8----------SK9----------SK10++++++++-
++SK11+++++++++++++++++++++++++++++++SK12+++++++++
+++SK13++++++++++++SK14++++++++++SK15++-++++++-
+SK16+++++++++++++SK17+++++++++++SK18+--+-+--
++SK19++++++++++++++++++SK20++++++++++++++SK21++++
++++++++++++
从图1和表1可以看出，红树林内生真菌的次级代谢产物大多具有生物活性，但
强弱差异很大，其中SK1、SK5、SK7、SK11菌株抗肿瘤及抗菌活性较好。

进一
步的抗菌活性复筛结果确定SK11菌株活性最强，其抗菌活性(图2)与阳性对照相似，因而选取SK11作为扩大培养跟踪分离的目标菌株。

a～f(μL)：1,3,5,7,10,12; g. Positive control图2 不同用量SK11粗提物的抗菌活性Fig.2 The antibacterial activities of different dosage of crude extract of the strain of SK11
2.2 活性菌株鉴定
SK11菌株的ITS区克隆产物所得序列在Genebank中(登录号为EU807936)用Blast进行相似性分析，与Alternaria sp.的相似性达到99%以上，可确定其为链
格孢霉菌(Alternaria sp.)。

2.3 粗分组分生物活性测试
用不同配比的EA/PE洗脱剂洗脱下来的粗分组分的生物活性测试结果见图3。

图3 粗分组分生物活性Fig.3 The biological activities of rough components
从图3可以看出，活性组分集中于EA/PE体积比在3∶7～2∶3与100%EA极性
区间段，由于100%EA极性段组分较难分离，后续实验主要对EA/PE体积比
3∶7～2∶3极性段组分进行分离纯化。

2.4 代谢产物的结构鉴定
对EA/PE体积比3∶7～2∶3极性段的活性组分进行分离纯化得到4个化合物：A、B、C、D，其中A和B均具有较强的抗菌活性；C 和D没有活性。

化合物A 为无色晶体，溶于甲醇，熔点为174～176℃。

波谱数据为：FABMS：287[M+1]+；1HNMR (CD3COCD3, TMS)，δH ：13.36 (1H, s), 6.86(1H, d)，6.80(1H, d)，6.44(1H, d)，6.29(1H, d), 3.96(3H, s)，3.92(3H, s)，2.81(3H, s)；13CNMR(CD3COCD3, TMS)，δC ：182.51(C), 165.94(C), 163.89(C),
163.88(C), 159.52(C), 157.06(C), 143.60(C), 115.45(CH), 103.08(C), 104.2(C), 98.53(CH), 96.81(CH), 92.09(CH), 55.65(CH3), 55.60(CH3), 23.31(CH3)。

从MS谱得到其分子离子峰m/z为286，结合NMR推断其分子式为C16H14O5，计算得其不饱和度为10。

1HNMR中δH 13.36(1H, s)位于低场尖峰，为一活泼
氢且应与羰基相邻形成分子内氢键，δH 6.86、6.80、6.44、6.29为苯环上间位氢信号，δH 3.96和δH3.92为甲氧基上的氢信号；13CNMR中， 1个形成氢键羰
基碳δC 182.51，2个甲氧基碳δC 55.60、55.65。

与标准谱图对照[10]，推测化合物A为Lichenxanthone(结构式见图4)。

图4 Lichenxanthone和Bikaverin的结构Fig.4 Structures of Lichenxanthone and Bikaverin
Lichenxanthone是Pettit等[11]从巴西坚树 Gustavia hexapetala 中分离得到的，该化合物对淋巴白血病P388、胰腺癌细胞 BXPC-3、乳腺癌细胞 MCF-7、中枢神经胶质瘤细胞SF-268、肺癌细胞 NCI-H460、结肠胰腺癌细胞 KM20L2、前列腺癌细胞 DU-145的GI50(μg·mL-1)值分别为大于10、2.5、4.1、3.0、7.1、2.0、3.7，具有良好的抗癌、抗肿瘤活性；对链霉菌、毛霉菌、假丝酵母菌等也具有较
好的抑菌活性[12]。

化合物B 为红色粉末，其波谱数据为：EI/MS:382(基峰)，367, 339, 325, 311, 283, 269, 241, 212, 184, 77, 69；1HNMR(DMSO-d6, 300 MHz)，δ: 13.29(s, OH), 12.76(s, OH),6.79(d, 2.4 Hz, 1H), 6.91(d, 2.4 Hz, 1H),6.34(s, 1H), 3.96(s,
3H), 3.94(s, 3H), 2.87(s, 3H)。

EI/MS显示分子离子峰为382，1HNMR有2个螯合羟基δ 12.76、13.29，2个
间位耦合芳香氢δ 6.91、 6.79(J=2.4 Hz)和1个孤立芳香氢6.34，3个甲基3.96、3.94、2.87；13CNMR显示有20个碳。

由此可推断该化合物的分子式为
C20H14O8，文献查阅后发现同已知化合物比卡菌素的谱图数据几乎一致[13]，
且两者的EI/MS碎片离子峰完全一致，因此确定化合物B为Bikaverin(结构式见
图4)。

Bikaverin对肺癌细胞NCI-H460、胰腺癌细胞MIA Pa Ca-2、胸腺癌细胞MCF-
7以及神经胶质瘤细胞SF-268具有细胞毒性，并有较好的抗菌活性。

3 结论
采用生物活性跟踪法对广西山口红树林内生真菌SK11次级代谢产物的抗菌、抗肿瘤活性成分进行了研究，用分子生物学方法鉴定该菌株为链格孢霉菌(Alternaria sp.)，首次从该属中分离到了活性成分Lichexanthone和Bikaverin。

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