CTAB—硅珠法提取DNA实验流程

CTAB—硅珠法提取DNA实验流程
前言:
实验是要求非常严谨的过程,每个一步骤都可能对后面的操作产生很大影响,乃至影响后面的结果.一步错,步步错,每一个操作的失误都可能导致整个实验的失败.
事实求是与踏踏实实的作风是每个做实验的人必备的基本品质.永远记住,任何弄虚作假的行为都是可耻的.
在这个充满学术腐败的科学界,保持自己的纯真.
谨记
1.材料的采集
采取植物的嫩叶,可以用硅胶干燥保存,也可以用冰袋,主要是防止叶片组织的降解及叶片的褐化.用泡沫塑料箱子带回,置于-70℃冰箱保存.
2.CTAB—硅珠法提取DNA实验流程
各加入液体的配制：
1、CTAB提取液：
2%（W/V g/mol ）CTAB；
5%（W/V g/mol）PVP；
1.4mol/lNaCl；
20mmol/L EDTA PH=8.0；
l00mmol/l Tris-HCl PH=8.0；
2%(V/V)巯基乙醇(临时加入)
配制量：500ml
配制方法：
(1)计算所需组分量
CTAB 10g 需热磁力搅拌
PVP 25g
NaCl 40.908g
EDTA.Na2.2H2O 3.7224g 调PH=8 冷却为常温时(母液)
Tris 6.057g
(2)称取CTAB 10 g，NaCl 40.908g，PVP 25g置于500ml烧杯中
(3)加入约300dd H2O(双蒸水)充分磁力搅拌溶解
(注意：EDTA和PVP较难溶，加热溶解的同时用热磁力搅拌直至完全的透明为止)
(4)量取20mlEDTA(0.5mol/l PH=8 )，50ml Tris-HCl(1 mol/l PH=8)溶液于烧杯中，均匀混合
(5)将烧杯溶液定容至500ml后，高温高压灭菌
(6)室温保存。

0.5mol/LEDTA 配制
组分浓度：0.5mol/l EDTA，PH=8
配制量：500ml
配制方法(1)称取93.06克EDTA.Na2.2H2O，置于500 ml烧杯中
(2)加入约400ml dd H2O.用热磁力搅拌器充分搅拌
(3)用NaOH调节PH值到8，约用10克固体NaOH
(4)在溶液冷却后，再用NaOH调节至PH=8
(5)加dd H2O将溶液定容到500 ml
(6)高温高压灭菌后，室温保存
NaOH溶液的配制
组分浓度：5 mol/l NaOH
配制量：100 ml
配制方法(1)称取固体NaOH20克于容器中
(2)加入dd H2O定容到100 ml
100 mmol/l Tris-HCl的配制
组分浓度：mmol/l Tris-HCl，PH=6.4
配制量：250 ml
配制方法(1)称取3.025克Tris于250 ml烧杯中.
(2)加入约200ml dd H2O充分搅拌溶解.
(3)用浓盐酸调节PH值到6.4.所用浓盐酸约3 ml
(4)将溶液定容至250ml
(5)用棕色瓶分装于4度冰箱中
(6)如使用，用水浴加热溶解.
2、氯仿-异戊醇的配制：
配制方法(1)简单的体积混合，既要求比例为24：1即可
(2)储存于棕色玻璃瓶子中
(3)置于4度冰箱以便日后使用
3总的实验流程
3.1．总的DNA的提取：
1. 在10ml离心管（eppendorf管）中加入4mlCTAB提取液及80ul巯基乙醇，在65℃水浴锅中预热
2. 取材料1-2g于研钵中，加入适量液氮迅速多次研磨成细粉状，转至预热的CTAB提取液中，用封口膜将离心管封密以防止巯基乙醇挥发.放回水浴中保温30分钟，保温过程中轻晃几次，保持摇匀.
3. 取出Eppenedorf管.置于冰上迅速冷却到室温，加入等体积的4ml氯仿-异戊醇（24：1），轻微混合均匀且充分，使其彻底地混合成乳状液，然后4℃下离心12000rpm 10min，轻轻将上清液吸取1ml于1.5ml离心管，放于-20℃冰箱中备用.
各加入液的用途：
（1）去污剂：
CTAB：可将细胞膜裂解，使DNA释放到提取液中，同时也使组织匀浆中的蛋白质变性. EDTA：能与DNase的辅助因子Mg2+结合，使DNase失去活性，不能降解从细胞中释放的DNA.
（2）还原剂
巯基乙醇：它抑制从细胞中释放的多酚氧仿.防止植物组织发黄变褐.
（3）氯仿—异戊醇：它可把组织匀浆中变性的蛋白质除去，将DNA与细胞中的蛋白质、碳
水化合物等分开除去.
（4）RNase：它可去除核酸中的RNA，只留下DNA.
3.2．总DNA的纯化
操作步骤：
1. 取出1.5ml离心管，内含所取DNA，加入100ul硅珠悬浮液（此液要求先行涡旋再使用），
使用涡旋振荡器大约15s，使之充分混匀，于室温静置10分钟，再振荡5秒，后离心：8000rpm 15s 4度，去除上清液得到硅珠——核酸复合物.
2. 将复合物用镊子一次打两个，打成液状，使之完全分散，加入漂洗液1ml，再涡旋充分混匀，后离心8000rpm 15s 弃掉上清液.
3. 重复上一步一次.
4. 用70%的1ml乙醇将硅珠——核酸复合物漂洗两次.每次涡旋充分混匀后，离心8000rpm 15s，弃上清液，打散，最后用1ml无水乙醇再漂洗一次，用涡旋混匀离心8000rpm 15s，然后将离心管管口打开倒置在吸水纸上，再将沉淀置于真空冷冻干燥机中风干复合物10分钟.
5. 加入100ulTE缓冲液充分混匀后，于56度水浴中保温10分钟，然后离心12000rpm 5min.取上清液即为所需的DNA.
6. 将余下的复合物再次完全打散（即涡旋），加入100ulTE缓冲液进行第二次重旋，并于56度水浴中保温10min，12000rpm 5min，取上清液于步骤5管中共存.
7. 将两次二合一的上清液离心混匀14000rpm 10min ，取上清液存于-20℃冰箱中.
仪器的使用
真空干燥器：
在使用前要求先预热30分钟，只打开1号阀门.
打开盖子平衡放入离心管，然后顺次开启2号——3号——4号——5号门.进行干燥处理5分钟.
关闭各阀门.顺序为5号——4号——3号——2号——1号阀门.
各加入液的配制
1、硅珠悬浮液的配制
（1）称取1.2g硅珠粉，溶解于10ml无菌水中.
（2）放入4℃冰箱备用.
（3）使用时先涡旋使其混合均匀.
2、漂洗液的配制
称取GuSCN（可能产生有毒气体，要求在通风橱中进行）120克溶解于100mlTris-HCl(100mM PH6.4)中.要求在60℃水浴中溶解.
3、TE缓冲液的配制
10×TE，500ml配制如下：
将100mM Tris-Hcl（PH=8.0）6.057g与10mM EDTA（PH=8.0）1.8612g溶于400ddH2O 中，调PH=8.0，定容到500ml。

3.3.DNA样品浓度、纯度测定
取4ul DNA水溶液用双蒸水稀释到400ul，用紫外分光光度计测定其D23Onm、D260nm、D280nm值.根据D260nm值估测浓度。

根据D260nm/D23Onm、D260nm/D280nm值估测其纯度.
（1）浓度计算公式：对于双链DNA而言D260nm为50ug/ml
DNA样品的浓度（ug/ml）= D260nm×稀释倍数×50/1000
（2）纯度估测标准：纯的DNA溶液其D260nm/D280nm=1.8；D260nm/D23Onm ＞2.0
DNA浓度的精确测定：
去除一定量的DNA，稀释成200ug/ul，配制少量400、200、100和50 ng 的λDNA.取标准λDNA和样品各1ul，进行0.8%的琼脂糖凝胶电泳.紫外灯下比较样品DNA条带的亮度，并对DNA样品进行定量、调整样品的DNA的量与100ugλDNA的亮度相一致.
总的DNA 跑出来条带在紫外光下看应该是明亮的一条,没有拖尾的现象,若有的话可能DNA部分降解或提纯的不彻底,含有的RNA较多.虽然SSR对模板的要求不是太严格,具体能否扩出条带,还须实验证明,或重新提取.
2.PCR扩增
SSR-PCR扩增反应体系
1、10ul反应体系：
调温高压灭菌水H2O 5.45ul 5.45ul×a 5.45ul×a×b
10×Buffer 1ul 1ul×a 1ul×a×b
2mM-dNTP 1ul 1ul×a 1ul×a×b
25mu-MgCl2 1ul 1ul×a 1ul×a×b
r-T aq 0.05ul 0.05u×a l 0.05ula×b
Primer+ 0.25ul 0.25ul×a 0.25ul×a×b
Primer- 0.25ul 0.25ul×a 0.25ul×a×b
DNA模板 1ul 说明：a个反应量=不同模板n+2，b为引物数+2
2、作程序及其注意事项：
1) 分装各型枪头.
2) 分装各型离心管.
3) 顺次用碳笔标明引物号，小master顺序号及总master顺序号.、
4) 收取冰块半盘，将取出各液放于冰上.
5) 配总master，先计算好a×b
6) d-NTP和MgCl2要求加样前先轻微涡旋混匀， T aq酶要求在冰箱口取用.
7) 配master的顺序：H2O——Buffer---dNTP---MgCl2---T aq
8) 轻涡旋总Master
9) 分装C个引物个小Master
10) 向C个小Master加入C个引物
11) 将含引物的C个Master涡旋混匀
12) 将N个模版点加到N×C个小离心管中，各含1ulDNA
13) 将各小Master，每9ul加入到含1ulDNA的离心管中
14) 时刻注意更换枪头，防止交叉感染，尽量不要将枪头放在液面下.
15) 将扩增好的DNA进行溴酚蓝点样，每离心管8ul
3、各加入液的配制
（1）引物的稀释
1) 每管引物先1000rpm 3min进行离心，将附在管壁上的粉末或膜状物离心到底部，小心打开盖子.
2) 加入经高温高压的灭菌水.针对不同的引物加入不同的量
3) 使最终浓度都为10um/L
（2）溴酚蓝的配制
1) 将0.125克溴酚蓝，20克蔗糖溶解为50ml的ddH2O
2) 再进行过滤
3) 放于4℃冰箱中储存
（3） Buffer的配制
1）1×TE Buffer
组成浓度：10mM Tris-HCl 1mM EDTA PH=8.0
配制量：500ml
配制方法：量取下列溶液于500ml烧杯中
1M Tris-HCl Buffer PH=8.0 5ml
0.5M EDTA PH=8.0 1ml
向烧杯中加入约400mldd H2O均匀混合；将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌；室温保存.
2）10×TE Buffer
组成浓度：100mM Tris-HCl 10mM EDTA PH=8.0
配制量：1000ml
配制方法：量取下列溶液于1升烧杯中：
1M Tris-HCl Buffer PH=8.0 100ml；
0.5M EDTA PH=8.0 20ml
向烧杯中加入约800mldd H2O均匀混合；将溶液定容到1升后，高温高压灭菌；室温保存. 1MTris-HCl 的配制：
组分浓度：1M PH=7.4 7.6 8.0
配制量：500ml
配制方法：称取6.057克Tris置于500ml烧杯中；加入约400ml的dd H2O充分搅拌溶解；按下表量加入浓盐酸调节所需PH值
PH值浓盐酸量
7.4 35ml
7.6 30ml
8.0 21ml
将溶液定容到500ml；高温高压灭菌后，室温保存.
PCR反应体系
1、本实验样品所采用的反应程序：
2、PCR扩增仪的操作：
1）先通过观察哪个指示灯是空的扩增仪
2）右旋打开盖子，按顺序摆放并用手柄轮压实
3）做旋盖好盖子至刻度处
4）打开操作程序，选好人名反应体系并逐一确定
5）掌握扩增仪时间2:30降温需30分钟
聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE
PAGE操作流程及注意事项：
1、涂胶
1）将有耳玻片（耳朝下）泡于反硅化剂中，新液25分钟，旧液30分钟.
2）涂无耳正面玻片硅化剂.均匀点四滴，轻而匀的沿一个方向涂三次，静10分钟.
3）到时间取出.打开通风橱风干30分钟.
2、封胶
1）将两玻片对贴于橡胶框中，放平，用力拧死，夹住橡胶管.
2）溶废琼脂胶，分两次：第一次50秒，第二次10-20秒，防止沸出.
3）用小细长枪头通透加胶枪头，便于加样通畅，少起气泡.
4）吸2500-3000ul液胶加速沿玻片边缘快速顺下滴，将两面玻片充分封死，防止漏胶.以水平底线面水平高于底为佳，静止凝胶15分钟.（有时可先在封口加一点TBE以润滑玻片，利于胶流下）
3、灌胶
1) 用长细枪头透开加胶枪头
2) 从中间加入，每次不要全部打完，留一点在枪头内.防止断流而导致胶中含有气泡.
3) 插梳子时两端平整，梳子紧贴玻板，梳齿头部不可有气泡.
4) 拔梳子时先加一倍TBE液将梳子泡透，然后平行用力拔出.
5) 在插梳子15分钟内跟踪观察，适当下按，保证孔的深度.
6) 等待2小时，以便胶充分凝固.
4、吹孔
1）向中间槽加入1倍粗制TBE，要淹没过内玻片约1厘米.
2）拔梳子，小心平稳，均匀平衡.
3）调1000p枪到300-600ul，进行吹孔，将小孔内沉淀物吹打干净，加样中再视时吹孔.
5、加样
1）用细长专用枪加入DNA 0.5ul.
2）一手托另一臂的肘，以保证加样手不抖.
3）一定垂直加到孔中去，不脱尾，不吸水，不靠壁，干净利落.
4）加完一次.在放于桌旁的吸纸上，将细枪头上余液吸干.
5）首、中、尾各留1到2个孔，两面胶孔的Marker不完全一样，以便区分.
6）加Marker 0.15ul 一般取0.3ul每孔注如一半，可用两个孔.
6、跑胶
1) 向两侧槽中加入粗制TBE，至U管线处.
2) 打开电源，稳压到120V
3) 电泳2h左右
4) 当样品跑到底部2cm处，关闭电源.
7、撬玻片
1）刀片不伸入过深.刀片平行于玻片，稍用力.
2）将没有硅化剂的无耳玻片放于水盘中，还有梳子.
3）清理琼脂胶，放于烧杯中.
4）胶玻片放于盘中，银染.
各加入液的配制
1、反硅化剂的配制
1）量取500ml ddH2O.
2）用冰乙酸把ddH2O PH调至3.5.
3）再加Bind-silica 2ml.
4）用热磁力搅拌器搅拌均匀.
2、TBE电泳母液（10×）的配制
1）分别称取54克Tris碱，27.5克硼酸，20ml 0.5mol/EDTA（PH=8.0）
2）将各组分别加入1升烧杯中，用ddH2O定容到1升.
3）在电泳时使用1倍工作液，按1：4与水混合.
4） 1倍液是为了增加电泳工作液的电流的电流量.
5）盛于玻璃瓶，在室温保存.
3、聚丙烯酰胺的配制（8%）
组分浓度：80%
配制量：500ml
配制方法：量取210克尿素，1克甲叉，39克丙烯酰胺，放入500ml烧杯中.加入少量水及
10×TBE 50ml，用搅拌器搅拌均匀，用微波炉加热四次（约20秒）助热溶解，透明无杂质.用双蒸水定容，溶后于4度冰箱保存.（有杂质需过滤）
4、灌胶液的配制
对于使用的灌胶要在8%胶中加入东西.取35克8%胶液，向其中加入175ul 10%APS和35ul TEMED；缓慢混合，不可使其产生气泡.（10%APS：取1g 过硫酸铵，加入10ml高温灭菌水）
银染操作步骤：
（1）取下带胶玻璃板，用dd H2O冲两次，每次2分钟.
（2）用固定液固定10分钟.
（3）用dd H2O清洗两次，每次2分钟.
（4）加AgNO3溶液，银染6到7分钟.
（5）用dd H2O清洗两次，每次2分钟.
（6）加入显影液，静候20到30分钟至显出图像为止.
（7）用自来水冲洗，贴上顺序标签.
（8）拍照近景端平，保持标签清晰.
各加入液的配制
1、显影液的配制
量取50ml 30%NaOH（15g）、10ml 0.756%四硼酸钠和10ml甲醛，用双蒸水定容到1升；在室温保存.
2、固定液的配制
称取200ml无水乙醇和10ml纯乙醇，加入2升烧杯中，用dd H2O定容道2升
3、AgNO3的配制
量取AgNO3原液2500ul；将250ml dd H2O和2500ul AgNO3加入胶玻片上.
（AgNO3原液的配制：50ml 中含AgNO3 7.5g 浓度为0.15g/ml）。