211132699_结核分枝杆菌fadD家族蛋白的研究进展

·综述·
摘 要：结核分枝杆菌复合群感染导致的结核病依然威胁着全球人类及动物的健康。

结核分枝杆菌含有复杂的细胞壁结构，其脂质成分与细菌的毒力、致病性、耐药性密切相关，结核分枝杆菌有250个基因参与脂类物质的合成与代谢，其数量是大肠杆菌的4倍之多，fadD 家族也是众多脂质代谢基因中的一类，在细菌的生命周期或者在其致病中扮演着重要的角色。

本文对结核分枝杆菌fadD 家族蛋白结构、作用机制、调控和应用前景进行了综述，希望能为结核疫苗、诊断方法等的研发提供理论基础。

关键词：结核分枝杆菌；fadD 家族；功能研究
中图分类号：R378.911；S852.618 文献标志码：A 文章编号：1674-6422（2023）01-0222-06
Research Progress of fadD Family Proteins of Mycobacterium tuberculosis
SHI Hongling 1,2, LI Qianqian 1,2, SU Li 1,2, GUO Aizhen 1,2,3, CHEN Yingyu 1,2,3
(1. State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 2. The College of V eterinary Medicine, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 3. National Animal T uberculosis Laboratory, Huazhong Agricultural
University, Wuhan 430070, China)
结核分枝杆菌fadD 家族蛋白的研究进展
师红铃1,2，李倩倩1,2，苏 莉1,2，郭爱珍1,2,3，陈颖钰1,2,3
（1.华中农业大学 农业微生物资源发掘与利用全国重点实验室，武汉430070；2.华中农业大学动物医学院，
武汉430070；3.华中农业大学 国家动物结核病专业实验室（武汉），武汉430070）
Abstract: Tuberculosis caused by Mycobacterium tuberculosis complex still threatens the health of humans and animals worldwide.
Mycobacterium tuberculosis contains a complex cell wall structure, of which the lipid composition is closely related to the virulence, pathogenicity and drug resistance of the bacteria. Mycobacterium tuberculosis has 250 genes involved in the synthesis and metabolism of lipid substances, which are four times as many as E. coli . fadD family is a kind of lipid metabolism gene and plays an important role in the life cycle or pathogenicity of the bacteria. This article mainly reviewed the structure, mechanism of action, regulation and application prospects of fadD family in the hope of providing a theoretical basis for the production of safe and effi cient vaccines and convenient diagnostic method for tuberculosis.
Key words: Mycobacterium tuberculosis ; fadD family; function
收稿日期：2020-07-03
基金项目：湖北省自然科学基金（2019CFB459）；国家现代农业（肉牛/牦牛）产业技术体系（CARS-37） 作者简介：师红铃，女，硕士研究生，预防兽医学专业通信作者：陈颖钰，E-mail：********************
Chinese Journal of Animal Infectious Diseases
中国动物传染病学报2023,31(1):222-227结核病是由结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis Complex）引起的一种慢性、消耗性
人畜共患病[1]。

据世界卫生组织（World Health Organization, WHO）统计，2018年全球结核新发病例约有1000万，因结核病死亡人数约为149万；新
增约50万利福平耐药结核病例，其中78%为耐多药性结核病例；耐药结核病仍然是全球公共卫生的威胁。

此外，引起人类结核病的主要为结核分枝杆菌和牛分枝杆菌，据报道约为10%的结核病例源于牛分枝杆菌[2-3]。

目前结核分枝杆菌致病机制的尚不清
· 223 ·
师红铃等：结核分枝杆菌fadD 家族蛋白的研究进展第31卷第1期楚，严重阻碍了该病诊断、疫苗等技术的研发，为结核的防控带来严峻挑战。

fadD 为腺苷酸形成酶超家族成员之一，具有多
种多样的催化活性与生物学功能。

结核分枝杆菌具有36个fadD 基因，虽然大多数基因的确切功能还未可知，但是其中已有数个基因被证实参与合成病原菌存活和毒力所需的脂质
[4-5]。

而结核分枝杆菌拥有
丰富的脂类物质，其干重占到细胞壁干重的60%；细胞壁的高脂含量使其成为宿主自身免疫系统和抗分枝杆菌治疗剂的有效通透性屏障，且细胞壁的脂质成分与结核分枝杆菌的致病性、毒力、免疫逃避、耐药性等方面也密切相关[5-7]。

因此，有必要对分枝杆菌脂质代谢关键基因fadD 开展较为详尽的研究，探究其在致病方面发挥的作用，从而为疫苗和新药的研发提供有价值的新思路。

1 fadD 家族蛋白的分类以及结构特征
结核分枝杆菌共可编码36种fadD 蛋白，根据序列分析，可将这些蛋白可以分为2类，一类属于脂肪酰基AMP连接酶（Fat acyl: adenylate ligase, FAAL）家族；另一类属于脂肪酰基CoA连接酶（fatty acid coenzyme Aligase, FACL）家族。

研究发现，结核分枝杆菌fadD 蛋白由一个较大的N端结构域和一个较小的C端结构域组成[8]（图1）。

解析蛋白质的基本结构，不仅可以了解蛋白质内部结构域之间的相互作用，深入了解其分子机制，还可以为针对此蛋白质的药物设计提供基础。

目前，已对4种fadD 家族的蛋白质进行了结构解析，分别是fadD28的N-末端结构域[9]、fadD13[10]、fadD10[11]和fadD32[12]。

其中，
fadD28蛋白是fadD 蛋白家族中第一个被解析出的N末
端结构域蛋白，而fadD13是第一个被解析出全长结
构的蛋白。

图1 fadD 蛋白的三维结构[5]
Fig.1 Three-dimensional model for fadD proteins [5]
2 fadD 家族蛋白的功能研究
在生物系统中，脂肪酸通过各种FAAL和FACL 活化为酰基—腺苷酸（FAA），FAAL主要是将长链脂肪酸活化为酰基—腺苷酸，然后将其转移至多功能聚酮化合物合酶（PKS），用于进一步扩展延伸链，从而提供结核分枝杆菌中发现的大多数高度官能化的脂质，例如甲硫酚二角酰亚胺（phthioceol, dimycoceates, PDIM）、硫脂、霉菌酸和霉菌素[8]；FACL则通过以下两步机制激活脂肪酸和其他疏水性底物：首先，使底物与ATP反应，形成酰基-腺苷酸中间体（酰基-AMP），同时释放焦磷酸盐；随后，该酰基-AMP中间体与CoA发生反应，生成脂肪酰基-CoA硫酯，并将其用于脂肪酸转运，蛋白质酰化，能量产生和磷脂生物合成等[13]（图2）。

目前已
报道的部分FadD家族蛋白的功能见表1。

图2 fadD 蛋白的催化机制
Fig.2 Catalytic mechanism of fadD protein
表1 部分fadD 家族蛋白的功能
Table 1 Functions of some fadD family proteins 基因Gene 功能Function 文献Literature
fadD1胆固醇分解代谢
[14]fadD2介导吡嗪酰胺（PZA）抗性[6]fadD3胆固醇分解代谢[15]fadD5维持细菌的胞内生长[16]fadD8胆固醇分解代谢[14]fadD10从头合成磷脂[17]fadD13影响细菌胞内生长[7]fadD17胆固醇分解代谢[18]fadD19胆固醇分解代谢[19]fadD21乙酰海藻糖生物合成[20]fadD22PGL 生物合成[21]fadD26DIM 生物合成[21]fadD28PDIM 生物合成[9]fadD29PGL 生物合成[21]fadD32分枝菌酸生物合成[22]fadD33
分支菌素生物合成
[23]
2.1 fadD 蛋白参与脂质的生物合成与分解代谢 结核分枝杆菌的一个独特特征是脂质成分含量复
· 224 ·中国动物传染病学报2023年2月
杂，其中分枝菌酸、酚类糖脂（phenolic glycolipid,
PGL）、PDIM、苯二酚二椰油酸酯（1,3-dithian-2-
yl-melhyl, DIM）是分枝杆菌所特有的，且与细菌的
毒力和致病性密切相关。

分枝菌酸已被证明对细菌的生存至关重要[4]，
fadD32参与了其生物合成[22]。

fadD33催化了结核
分枝杆菌的分枝杆菌生长素的形成[24]。

有数据表
明，胆固醇是潜伏感染期间的关键碳源，而胆固
醇的分解代谢会促进脂质毒力因子前体丙酰辅酶A
的汇集，进而在毒力方面起作用[25]，fadD1、fadD3、
fadD8、fadD17、fadD19参与了胆固醇的分解代谢[14]；
fadD26蛋白是产生苯二酚二椰油酸酯（DIM）所
必需的；fadD22和fadD29基因主要参与PGL的生物
合成，两者的不同点在于fadD22具有p-羟基苯甲
酰-AMP连接酶活性，fadD29脂肪酰基-AMP连接酶
活性[21]。

fadD28基因对于仅在致病性分枝杆菌的细胞壁中发现的强毒的PDIM脂质的生物合成至关重要[5]。

2.2 fadD蛋白具有免疫调节功能 结核分枝杆菌可以通过多种途径感染宿主并在宿主中维持生存，其在宿主体内存活，需逃避机体的免疫反应，例如：阻止巨噬细胞吞噬溶酶体成熟及酸化、抑制氧化应激反应、抑制细胞凋亡及自噬等[26]，了解结核分枝杆菌与宿主细胞的相互作用对于开发有效的疾病控制手段至关重要。

fadD13是一种外周膜蛋白，在与宿主巨噬细胞的互作过程中，主要与真核翻译延伸因子-1α1（eukaryotic elongation factor 1A1, eEF1A1）互作，并通过NF-κB信号通路调节宿主细胞炎性因子的分泌。

研究发现fadD13基因缺失后，能够有效降低促炎细胞因子IL-1β、IL-18和IL-6的产生，且降低巨噬细胞中结核分枝杆菌的存活率（图3）[7]。

表明fadD13是巨噬细胞中细菌增殖的关键因子，对宿主具有免疫调节功能，同时也暗示了fadD家族中其他蛋白也可能具有此潜力。

2.3 fadD蛋白家族的作用机制以及调控机理综合目前的fadD蛋白家族研究情况，发现主要有以下两种调控方式，分别是磷酸化调节和cAMP酰化调节。

结核分枝杆菌可以通过磷酸化来参与细胞内的许多代谢过程，其中fadD32被丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase, STPK）磷酸化，会导致其酶活性降低，进而影响fadD3/Pks13催化的缩合反应即分枝菌酸的生物合成，fadD32主要将酰基转移链转移到Pks13的N-ACP结构域上（图4A）[27]。

结核分枝杆菌fadD家族蛋白的另一种调控方式是cAMP酰化调节。

cAMP的唯一下游靶标是cAMP 结合蛋白赖氨酸酰基转移酶，此酶可以酰化脂肪酰基CoA连接酶，酰化作用发生在fadD酶活性位点的赖氨酸残基上，从而抑制脂肪酰基CoA连接酶的活性（图4B）。

fadD22被cAMP结合蛋白赖氨酸酰基转移酶酰化后，影响了体内PGL的生物合成，为cAMP在调节致病性分枝杆菌毒力中新作用提供证据[28]。

除此之外，fadD33的酶活性也受到cAMP结合蛋白赖氨酸酰基转移酶的影响，该方式由cAMP可逆地调控，fadD33被cAMP结合蛋白赖氨酸酰基转移酶酰化后，酶活性降低，影响分枝杆菌铁载体的形成，而结核分枝杆菌含有2种铁载体，已被证明是宿主中细菌毒力的关键成分[23]。

3 fadD家族蛋白的临床应用情况
3.1 具有作为结核疫苗的潜力fadD家族中的部分基因具有构建安全、有效的减毒菌株的潜力。

Vanessa 等[12]对fadD28
基因进行定向缺失，并探讨其菌株的
图3 fadD13调控模式图[7]
Fig.3 The regulatory model of fadD13[7]
· 225 ·
师红铃等：结核分枝杆菌fadD 家族蛋白的研究进展第31卷第1期毒力和对动物的保护效果，发现缺失此基因后，在SCID小鼠中的毒力低于野生型BCG-Pasteur株，在BALB/c小鼠和豚鼠中对结核分枝杆菌感染的保护性也较低，说明单独缺失此基因，并不能起到很好的免疫作用，可以与其他基因共同缺失，从而提高宿主的免疫保护性。

Troudt等[29]先是在小鼠感染模型中，发现SigE突变体比BCG更弱、更有效，随后在豚鼠模型中进行了验证，同样证明此缺失菌株能够诱导Th1免疫反应，减少细菌含量，并延长豚鼠的生存，此后为了提高免疫保护性，又构建了一个SigE、fadD26无标记双突变体菌株，采用裸鼠和免疫缺陷小鼠（SCID小鼠）等动物模型，证明了双重突变会降低肺的细菌负荷，对此突变体所诱导的保护也进行了表征，发现保护性更强，并且该突变体比前面的单缺失SigE突变体菌株更弱、更有效，是一种新的有前途的疫苗候选者[30]。

3.2 具有作为药物靶标的潜力 许多fadD 蛋白具有作为药物靶标的潜在能力。

抑制分枝菌酸途径是抗结核药物发现的可行策略之一；如一线抗结核药物异烟肼（Isonicotinic acid hydrazide, INH）就是通过作用于分枝菌酸的合成途径而起到积极的抗菌作用。

fadD32（研究最广泛的FAAL之一）是激活分枝菌
酸的长链分枝菌酸的必须酶。

fadD32基因的缺失，能够直接导致菌落形态由平滑变为粗糙，生长速度较野生型菌株迟缓[22]；fadD32的抑制剂是4,6-二芳
基-5,7-二甲基香豆素，在体外和体内均可以有效阻断细菌的复制，其活性位点为E120和F291。

因此，
fadD32具有作为抗生素开发的潜能[31]。

当结核分枝
杆菌暴露于酸性pH的环境中时，fadD13可以适当维持霉菌酸的成分与细菌细胞膜的渗透性，并于细菌的毒力和细胞内的生长息息相关，因此也具有发展成药物靶标的潜力[32]。

fadD 家族中参与结核分枝杆菌胆固醇降解的蛋白，也可能为开发新的抗结核药物提供新的靶标。

4 总结与展望
综上所述，结核分枝杆菌的众多fadD 蛋白中，虽然部分蛋白的结构及其生化功能有较为深入的研究，但大多数成员的作用机制尚不清楚。

已明确的是，fadD 家族的部分蛋白在药物靶标和疫苗研发中展现出了很好的前景，因此，深入研究该家族蛋白的功能，分析它们的活化作用，解析脂质对结核分枝杆菌的生存、毒力以及致病性的影响，将使我们对结核分枝杆菌细胞脂质成分合成与代谢的复杂性有更深入的理解，进一步为结核病新型疫苗和药物的研发提供必要的基础。

参考文献
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Mycobacterium tuberculosis complex differentiation by genomic deletion patterns with multiplex
polymerase
图4 fadD 家族蛋白调节模式图
Fig.4 fadD family protein regulatory pattern
A:磷酸化调节[28]; B: cAMP 酰化调节[29]
A: Phosphorylation regulation [28]; B: cAMP acylation regulation [29]
· 226 ·中国动物传染病学报2023年2月
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