化妆品中氨甲环酸的检测方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811361462.0
(22)申请日 2018.11.15
(71)申请人 广州智汇生物科技有限公司
地址 510700 广东省广州市黄埔区科丰路
31号G11栋502
(72)发明人 李丰　毓志超　郝燕娟　陈仙月　
(74)专利代理机构 北京超凡志成知识产权代理
事务所(普通合伙) 11371
代理人 严诚
(51)Int.Cl.
G01N 21/78(2006.01)
(54)发明名称
化妆品中氨甲环酸的检测方法
(57)摘要
本发明提供了一种化妆品中氨甲环酸的检
测方法，具体包括如下步骤：(A)在待测样品中依
次添加试剂A，试剂B摇匀，分离得到上清液；(B)
在上清液中添加试剂C摇匀分层后，分离下层液
添加显色剂，90℃加热，观察显色情况即可；其
中，所述试剂A为吐温-20、吐温-80、PEG -20000中
的至少一种，所述试剂B为DMSO 、DMF 、EtOH 、
CH 2Cl 2中的至少一种，所述试剂C为水、饱和氯化
钠溶液、饱和磷酸氢二甲溶液、饱和磷酸二轻钾
溶液、饱和磷酸氢二钠溶液、饱和磷酸二氢钠溶
液中的至少一种。

本发明的检测方法操作简便，
效率高，成本低，
值得广泛推广进行应用。

权利要求书1页 说明书6页CN 109115761 A 2019.01.01
C N 109115761
A
1.化妆品中氨甲环酸的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(A)在待测样品中依次添加试剂A，试剂B摇匀，分离得到上清液；
(B)在上清液中添加试剂C摇匀分层后，分离下层液添加显色剂，90℃加热，观察显色情况即可；
其中，所述试剂A为吐温-20、吐温-80、PEG -20000中的至少一种，所述试剂B为DMSO、DMF、EtOH、CH 2Cl 2中的至少一种，所述试剂C为水、饱和氯化钠溶液、饱和磷酸氢二甲溶液、饱和磷酸二轻钾溶液、饱和磷酸氢二钠溶液、饱和磷酸二氢钠溶液中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(A)中，所述试剂B为EtOH、CH 2Cl 2的混合液；
优选地，所述试剂C为饱和氯化钠溶液。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(A)中，添加的试剂A与待测样品的体积比为(1-3):1，更优地体积比为2:1。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(A)中，添加的试剂B与待测样品的体积比为(1-2):1，更优地体积比为1:1；
优选地，添加试剂B摇匀后静置30s以上，更优地静置40-50s。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(B)中，添加的试剂C与待测样品的体积比为(1-2):1，更优地体积比为1:1；
优选地，添加试剂C摇匀后静置30s以上，更优地静置40-50s。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(B)中，所添加的显色剂为茚三酮溶液。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(B)中，所述茚三酮溶液的溶剂为丁醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯中的至少一种。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(B)中，所述显色剂的添加量为待测样品的4-5wt％。

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(B)中，添加显色剂后振荡3-5s后再加热。

10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(B)中，加热的温度为92-95℃之间；
优选地，加热的时间为5min以上，更优地为6-8min。

权　利　要　求　书1/1页CN 109115761 A
化妆品中氨甲环酸的检测方法
技术领域
[0001]本发明涉及化妆品质量检测控制领域，具体而言，涉及一种化妆品中氨甲环酸的检测方法。

背景技术
[0002]氨甲环酸(又称为传明酸)是一种蛋白酶抑制剂，能抑制蛋白酶对肽键水解的催化作用，从而阻止了如发炎性蛋白酶等酶的活性，进而抑制了黑斑部位的表皮细胞机能的混乱，并且抑制黑色素增强因子群，再彻底断绝因为紫外线照射而形成的黑色素发生的途径。

即让黑斑不再变浓、扩大及增加，从而能有效地防止和改善皮肤的色素沉积。

[0003]在医学上应用于动脉瘤蜘蛛网膜下出血诊治，学界称之为断血炎作为凝血剂用途，诊治过程意外发现有使肌肤变白的副作用，所以利用在肝斑治疗和黑色素沈淀的药用处方签。

传明酸的美白机制是同时且迅速的抑制酪胺酸脢酵素和黑色素细胞的活性，并且防止黑色素聚集的情况，能阻断消弭因为紫外线照射而形成黑色素恶化的行进路径。

[0004]传明酸与传统美白成分比较能表达出效果稳定，受高温制作环境限制，不需要各类载体的保护传递效果,依然能达到美白效果,并无刺激性作用。

其外用能抑制黑色素形成及防止色素斑的形成，阻断黑色素传递之路径，卫生署规定浓度限量为2％-3％。

在美白过程中，以传明酸为主，搭配维生素C磷酸脂镁(APMg)做美白原料。

[0005]现今市面上存在很多美白祛斑类化妆品将含氨甲环酸的成分直接加入化妆品中，但由于是法定适应症之外的用法，无法保证用药安全，一旦产生法律纠纷，处理会很复杂。

氨甲环酸是临床上常用的止血药，滥用可能引起视力模糊、头痛、头晕、疲乏等中枢神经系统症状；过量可致颅内血栓形成和出血，引起继发性肾盂炎症和输尿管凝血块阻塞，此外还有腹泻、恶心及呕吐等症状。

[0006]现有技术中也有对氨甲环酸的相关检测研究的报道，比如《美白祛斑类化妆品中氨甲环酸的检测方法研究》中的记载，其建立了美白祛斑类化妆品中氨甲环酸的检测方法，采用C18色谱柱，以质量分数0.23％十二烷基硫酸钠溶液与甲醇(体积比60/40)的洗脱液为流动相，流速为1.0mL/min，检测波长为220nm，进行高效液相色谱定量检测。

结果检出，氨甲环酸在0～1.073mg/mL范围内线性关系良好，检测限为1.45mg/g，平均回收率为104.36％。

该法快速准确、专属性强、灵敏度高，可用于美白祛斑类化妆品中氨甲环酸的检测。

但该方法需使用高效液相色谱、液质联用仪及超高效液相色谱，存在检测成本高，操作方法复杂，人员专业水平要求较高等缺点，不利于日常多批量及时检测结果的发出，不利于企业或单位成本控制，不利于大范围推广，市民接受度低等缺点。

[0007]此外，文献：Determination of tranexamic acid content in Waixueting by spectrophotometry[J].J Lanzhou Med Coll(兰州医学院学报),2000,26(4):20-21中，采用分光光度法对外血停主药TA进行含量测定，结果发现在466nm处有最大吸收，且空白溶液无干扰，在10.0～62.5μg·mL浓度内线性关系良好，回收率达100.91％，RSD为1.09％，方法准确、快速、简便。

但该方法抗干扰能力差，对环境有一定程度的依赖，且操作容错率低，对
于人员要求比较高，新手不易于快速上手，推广力度差。

[0008]有鉴于此，特提出本发明。

发明内容
[0009]本发明的目的在于提供一种化妆品中氨甲环酸的检测方法，该检测方法的检测限度可以达到很低，只要化妆品中氨甲环酸的含量在3wt％以上均可以检测到，而且其较现有技术中的仪器等检测手段更加快捷，对环境要求低，操作准确度高，成本低，更加为人们所普遍接受，操作简单，无需专业人员也可实施操作，因此值得广泛推广进行应用。

[0010]为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
[0011]本发明提供了一种化妆品中氨甲环酸的检测方法，包括如下步骤：
[0012](A)在待测样品中依次添加试剂A，试剂B摇匀，分离得到上清液；
[0013](B)在上清液中添加试剂C摇匀分层后，分离下层液添加显色剂，90℃加热，观察显色情况即可；
[0014]其中，所述试剂A为吐温-20、吐温-80、PEG-20000中的至少一种，所述试剂B为DMSO、DMF、EtOH、CH2Cl2中的至少一种，所述试剂C为水、饱和氯化钠溶液、饱和磷酸氢二甲溶液、饱和磷酸二轻钾溶液、饱和磷酸氢二钠溶液、饱和磷酸二氢钠溶液中的至少一种。

[0015]现有技术中，其实市面上存在很多美白祛斑类化妆品将含氨甲环酸的成分直接加入化妆品中，但由于是法定适应症之外的用法，无法保证用药安全，一旦产生法律纠纷，处理会很复杂。

氨甲环酸是临床上常用的止血药，滥用可能引起视力模糊、头痛、头晕、疲乏等中枢神经系统症状；过量可致颅内血栓形成和出血，引起继发性肾盂炎症和输尿管凝血块阻塞，此外还有腹泻、恶心及呕吐等症状。

[0016]目前，国家食品药品监督管理总局暂未对美白祛斑类化妆品使用氨甲环酸的问题作出具体规定，但仍有必要对其加强监管，制订相应的检测方法和限量指标。

[0017]本发明为了解决以上技术问题，根据现今化妆品或其他原材料中添加氨甲环酸或残留氨甲环酸杂质的方法，优化前处理条件，完善检出限及检出结果，建立起一套完整的快速、准确的检测方法，为将来对氨甲环酸的管控贡献一份力量，而且该方法本身操作简便，成本低，操作环境要求也比较低，适于更为广泛的进行应用。

[0018]优选地，作为进一步可实施的方案，所述步骤(A)中，所述试剂B为EtOH、CH2Cl2的混合液，经过大量实践发现当采用EtOH、CH2Cl2的混合液时，其检测下限可以达到3％，提高了检测的灵敏度。

[0019]其中，上述所用的试剂中，考虑到化妆品原料略溶于乙醇，不溶于水而氨甲环酸易溶于水。

若直接用水溶液提取其中的氨甲环酸，由于脂溶性的化妆品原来干扰，造成一定的乳化现象，不易提取完全。

为了更准确全面地提取原料中氨甲环酸，有必要将样品全部或大部分溶解进行测定。

采用溶解能力较好的有机试剂如二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、二氯甲烷、无水乙醇、二氯甲烷-无水乙醇(EtOH、CH2Cl2的混合液)分别进行了实验。

结果表明，单一溶剂溶解性差，二氯甲烷-无水乙醇的混合溶液对其溶解性较好。

[0020]优选地，所述试剂C为饱和氯化钠溶液。

[0021]由于氨甲环酸易溶于水，适合用水溶液进行萃取，于是分别采用水、饱和氯化钠溶液、磷酸二氢钾缓冲盐溶液进行了实验，结果表明，用水萃取不宜分层，且易造成溶液浑浊。

饱和氯化钠溶液和磷酸二氢钾缓冲盐溶液分层良好，且溶液澄清。

考虑到氯化钠成本低廉，易获得，溶解速度相较较快利于大批量试剂配制制作，所以最终优选氯化钠饱和溶液。

[0022]优选地，作为进一步可实施的方案，所述步骤(A)中，添加的试剂B与待测样品的体积比为(1-3):1，更优地体积比为2:1。

[0023]优选地，作为进一步可实施的方案，所述步骤(A)中，添加的试剂B与待测样品的体积比为(1-2):1，更优地体积比为1:1。

[0024]优选地，添加试剂B摇匀后静置30s以上，更优地静置40-50s。

[0025]优选地，作为进一步可实施的方案，所述步骤(B)中，添加的试剂C与待测样品的体积比为(1-2):1，更优地体积比为1:1。

[0026]最好将所添加的试剂控制在一定的比例范围内，如果加量太大会影响溶液的分层以及澄清度，加量太小可能达到理想的萃取检测效果，因此需要控制在适宜的加量范围内。

[0027]优选地，添加试剂C摇匀后静置30s以上，更优地静置40-50s。

[0028]优选地，作为进一步可实施的方案，所述步骤(B)中，所添加的显色剂为茚三酮溶液。

[0029]优选地，作为进一步可实施的方案，所述步骤(B)中，所述茚三酮溶液的溶剂为丁醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯中的至少一种。

[0030]优选地，作为进一步可实施的方案，所述步骤(B)中，所述显色剂的添加量为待测样品的4-5wt％。

[0031]优选地，作为进一步可实施的方案，所述步骤(B)中，添加显色剂后振荡3-5s后再加热。

[0032]优选地，作为进一步可实施的方案，所述步骤(B)中，加热的温度为92-95℃之间；[0033]优选地，加热的时间为5min以上，更优地为6-8min。

[0034]所添加的显色剂一般为茚三酮溶液，后续在加热之前先振荡3-5s，以使其混合的更为均匀，加热的温度需要控制在90℃以上，如果温度太低不会有任何显色现象，加热的时间一般控制在5min以上，加热后观察反应现象，如果无色则表明其氨甲环酸的含量低于一定的水平，如果显蓝紫色，说明其含有一定量的氨甲环酸，根据其颜色的深浅可以一定程度的反应氨甲环酸的含量高低。

[0035]与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0036](1)由于现有技术中没有针对化妆品中氨甲环酸的快速检测方法，并且氨甲环酸的限量使用标准暂时仍未制定，本发明属于提前进行了方法准备，属于填补了相关的技术空白；
[0037](2)本发明的保护重点在于利用添加不同种类的溶剂，对目标机制中的目标物提取，从加入吐温-20助溶、二氯甲烷体系抗干扰提取目标物及氯化钠饱和溶液水洗净化，每一步都起到了至关重要的作用，均属于本发明整个方法中的关键所在，此外方法中所涉及的温度、时间等操作参数也至关重要，均需要控制在适宜的操作范围内。

具体实施方式
[0038]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。

实施例中未注明具体
条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

[0039]实施例1
[0040]对液体化妆品按照如下方法检测其所含的氨甲环酸：
[0041] 1.取1ml待测样品加入离心管中；
[0042] 2.向离心管加入1ml试剂A(PEG-20000)、2ml试剂B(CH2Cl2)，盖上盖子，上下颠倒2-3次摇匀即可，切勿大力振摇，静置30s后取出底层的全部清液部分至另一离心管中；[0043] 3.向上述清液所置的离心管中加入1ml试剂C(水)，盖上盖子，上下颠倒2-3次混匀即可，切勿大力振摇，静置30s左右待有明显分层；
[0044] 4.从上述离心管中取出下层清液置于新的离心管中，加入显色剂，显色剂的添加量为5wt％，大力振摇混匀3s后，置于90℃水浴锅中水浴加热5min，观察反应现象。

[0045]采用上述的检测方法，针对不同的氨甲环酸含量的液体化妆品标准样品(取样量均为1ml)的检测结果如下表1所示：
[0046]表1检测结果
[0047]
氨甲环酸含量显色现象显色程度
3％无色-
4％无色-
5％无色变为浅蓝紫色++
6％无色变为蓝紫色+++
7％无色变为深蓝紫色++++
8％无色变为极深蓝紫色+++++
[0048]实施例2
[0049]对液体化妆品按照如下方法进行检测其所含的氨甲环酸：
[0050] 1.取1ml待测样品加入离心管中；
[0051] 2.向离心管加入2ml试剂A(吐温-20)、2ml试剂B(EtOH)，盖上盖子，上下颠倒2-3次摇匀即可，切勿大力振摇，静置40s后取出底层的全部清液部分至另一离心管中；
[0052] 3.向上述清液所置的离心管中加入2ml试剂C(饱和磷酸氢二甲溶液)，盖上盖子，上下颠倒2-3次混匀即可，切勿大力振摇，静置40s左右待有明显分层；
[0053] 4.从上述离心管中取出下层清液置于新的离心管中，加入显色剂，显色剂的添加量为4wt％，大力振摇混匀5s后，置于92℃水浴锅中水浴加热6min，观察反应现象。

[0054]采用上述的检测方法，针对不同的氨甲环酸含量的液体化妆品标准样品(取样量均为1ml)的检测结果如下表2所示：
[0055]表2检测结果
[0056]
氨甲环酸含量显色现象显色程度
3％无色-
4％无色-
5％无色变为浅蓝紫色++
6％无色变为蓝紫色+++
7％无色变为深蓝紫色++++
8％无色变为极深蓝紫色+++++
[0057]实施例3
[0058]对液体化妆品按照如下方法进行检测其所含的氨甲环酸：
[0059] 1.取1ml待测样品加入离心管中；
[0060] 2.向离心管加入3ml试剂A(吐温-20)、1.5ml试剂B(EtOH+CH2Cl2)，盖上盖子，上下颠倒2-3次摇匀即可，切勿大力振摇，静置50s后取出底层的全部清液部分至另一离心管中；[0061] 3.向上述清液所置的离心管中加入1.5ml试剂C(饱和氯化钠溶液)，盖上盖子，上下颠倒2-3次混匀即可，切勿大力振摇，静置50s左右待有明显分层；
[0062] 4.从上述离心管中取出下层清液置于新的离心管中，加入显色剂，显色剂的添加量为4.5wt％，大力振摇混匀4s后，置于95℃水浴锅中水浴加热8min，观察反应现象。

[0063]采用上述的检测方法，针对不同的氨甲环酸含量的固体及半固体化妆品标准样品(取样量均为1ml)的检测结果如下表3所示：
[0064]表3检测结果
[0065]
氨甲环酸含量显色现象显色程度
3％无色变为蓝紫色+++
4％无色变为深蓝紫色++++
5％无色变为深蓝紫色++++
6％无色变为深蓝紫色++++
7％无色变为深蓝紫色++++
8％无色变为极深蓝紫色+++++
[0066]实施例4
[0067]具体操作步骤与实施例3一致，只是试剂B的用量为0.5ml。

[0068]采用上述的检测方法，针对不同的氨甲环酸含量的固体及半固体化妆品标准样品(取样量均为1ml)的检测结果如下表4所示：
[0069]表4检测结果
[0070]
氨甲环酸含量显色现象显色程度
3％无色变为浅蓝紫色++
4％无色变为蓝紫色+++
5％无色变为深蓝紫色++++
6％无色变为深蓝紫色++++
7％无色变为深蓝紫色++++
8％无色变为极深蓝紫色+++++
[0071]实施例5
[0072]具体操作步骤与实施例3一致，只是试剂C的用量为0.4ml。

[0073]采用上述的检测方法，针对不同的氨甲环酸含量的固体及半固体化妆品标准样品
(取样量均为1ml)的检测结果如下表5所示：
[0074]表5检测结果
[0075]
氨甲环酸含量显色现象显色程度
3％无色变为浅蓝紫色++
4％无色变为蓝紫色+++
5％无色变为蓝紫色+++
6％无色变为深蓝紫色++++
7％无色变为深蓝紫色++++
8％无色变为极深蓝紫色+++++
[0076]比较例1
[0077]其他操作步骤与实施例3一致，只是加热的温度为80℃，采用上述的检测方法，针对不同的氨甲环酸含量的液体化妆品标准样品(取样量均为1ml)的检测结果如下表6所示：[0078]表6检测结果
[0079]
氨甲环酸含量显色现象显色程度
3％无色-
4％无色-
5％无色-
6％无色-
7％无色-
8％无色-
[0080]尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。

因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。