窖池微生态调控对窖泥驯化及酒质影响的研究

窖池微生态调控对窖泥驯化及酒质影响的研究
施思乔宗伟"牛罗青春刘多涛"
(1.宜宾五粮液股份有限公司-四川宜宾644007;2.固态发酵资源利用四川省重点实验室？四川宜宾644007)
摘要:为更好地解析窖泥，为窖泥质量提升提供更多的技术储备，采用化学法和物理法对窖泥进行驯化。

化学法利用高通量测序技术解析老熟窖泥中核微生物样性，针对其中的主要菌群梭甲烷菌设计一无机盐培养基进泥核心菌群的驯化;物理法利不同生酸的，采法进行窖泥驯化。

，窖池微生态经化学法调酒样中的己酸乙酯量提高了44.67%,乳酸乙酯含量了37.25%；经物理法调控后酒样中的己酸乙酯量提高了12.22%,乳酸乙酯量先升后降，杂醇油中正丙醇含量了20.$%。

两种方法均了泥驯化的目的，综合酒质得到提高°
关键词：泥;微生态调控;化学法;物理法;驯化;酒质
中图分类号：TS261.1；TS262.3文章编号：0254-5071(2021)05-0163-05doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2021.05.030引文格式:施思，乔宗伟,罗青春，等•窖池微生态调控对窖泥驯化及酒质影响的研究[J]•中国酿造,2021,40(5)：163-167.
Effect of m icroecological regulation of p it on pit mud acclimation and liquor quality
SHI Si1,QIAO Zongwei®,LUO Qingchun1,LIU Duotao1
(1.Yibin Wuliangye Co.,LtJ.,Yibin644007,China;
2.SoliJ-state Fermentation Resource Utilization Key Laboratory of S ichuan Province,Yibin644007,China)
Abstract：In order to analyze pit mud and provide more technical reserves<or pit mud quality improvement,the pit mud was domesticated by chemical and physical methods.The diversity of prokaryotic microorganisms in aged pit mud was analyzed by chemical method high-throughput sequencing technology, and an inorganic salt medium was designed<or the clostridium and methanogens to domesticate the core microorganisms in pit mud.According to the di<-ferences in acid production at different levels of pit,the pit mud was domesticated by physical method replacement method.The results showed that the content of ethyl caproate in the liquor samples increased by44.67%and the content of ethyl lactate decreased by37.25%after the microecology of the pit mud was regulated by chemical methods.The content of ethyl caproate increased by12.22%after physical regulation,the content of ethyl lactate increased first and then decreased,and the content of n-propanol,one of the fusel oils,decreased by20.8%.Both methods achieved the goal of pit mud acclimation, and the comprehensive liquor quality was improved.
Key words：pit mud;microecological regulation;chemical method;physical method;acclimation;liquor quality
泥窖是酿造浓香型白酒的关键设备，栖息在窖泥中的微生物经过长期驯化，形成一个趋于成熟的微生态系统，使发酵过程中的酸、酯等呈香、呈味物质的含量和比例趋于协调、稳定，从而造就了以己酸乙酯为主体香的浓香型白酒的典型风格。

因此，老熟的窖泥是酿造优质浓香型白酒的重要条件之一。

目前,为了防泥化老化，以使新泥老熟窖泥转化，酒厂在窖泥驯化方面做了很多探讨和尝试，如以糟养窖、以黄水、蒸
酒等窖窖冋。

糟是一体，以糟窖要的糟发酵，窖泥的生长优质酒窖酒的香，一味，成，酒质量定
，酸，含的酸，是酸和乙
收稿日期：2020-09-24修回日期：2021-01-04
基金项目:公司专项科研基金(JSZX15JS002)酸，长期窖中，窖泥过酸化，
白，造成浓香型白酒主体香己酸乙酯含量降。

而白物中主要酸酸，酸
量0.1%,酸的生成[9-10], pH，窖泥,熟，最终导致香不协调，酒质。

为了使泥微生物老熟窖泥所的条件，研究也添的培养相关，进泥驯化。

但营养液中添的碳源，容剩，恶臭。

研究立足生产实际，利用物理法化学法进
微生态调控，最终驯化泥老熟，提酒质的目的。

:中，化学法是通过解析老熟窖泥中核微生物的群落结构，针性地设计了一纯无盐培的，己、方便易配制等优点。

另外，研究利不同部分生
作者简介:施思(1986-),女,工程师，硕士，研究方向为发酵微生物与酿酒技术。

*通讯作者:乔宗伟(1978-),男，高级工程师，硕士，研究方向为酿酒技术与装备。

酸情况的差异，尝试了一种物理置换法，利用窖池生酸的客观规律进行窖泥驯化，该方法不涉及任何化学物质的添加，不会产生任何安全问题，以期为窖泥的驯化养护提供新的思路和手段。

1材料与方法
1.1材料与试剂
1.1.1窖泥样品
老熟窖泥(1$、2$、3'):来源于车间生产窖池。

1.1.2培养基
专性培养基［11］:乙酸钠1%、甲酸钠0.2%、氯化镁0.02%、磷酸氢二钾0.05%、氯化Z0.75%,p/自然。

121!高压蒸汽灭菌20min。

1.1.3试剂
酸乙酸乙、酸乙、乙酸乙、异、
丁醇、异、、甲为纯)：天津市科密欧化学试有甲酸、乙酸、酸、丁酸、酸、酸和乳
酸(均为色谱纯)：美国Sigma公司；宏基因组脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)抽提试剂盒、细菌引物(341F：5'-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCCTACGGGNG-GCWGCAG-3'；805R:5'-GACTGGAGTTCCTTGGCACCC-GAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC-3')、古菌引物(第一轮为1st-340F：5'-CCCTAYGGGGYGCASCAG-3', 1st-1000R5'-GGCCATGCACYWCYTCTC-3'；第二轮为349F：5'-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTN(barcode)GYGCA-SCAGKCGMGAAW-3',806R：5'-GACTGGAGTTCCTTGGC-ACCCGAGAATTCCAGGACTACVSGGGTATCTAAT-3')：生工生物工程(上海)股份有限公司。

其他试剂均为国产纯。

1.2仪器与设备
UNIVERSAL320R冷冻离心机:德国Hettich公司;HWS26
:一科有T100TM Thermal Cyeler聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)仪：美国BIO-RAD公司；DYCZ-21电泳槽：北京六一生物科技有限公司;GelDoc IT TS2凝胶成像系统:美国UVP 公司；7890气相色谱(gas chromatography,GC)仪(配备火焰离子检测器(flame ionization detector, FID)检测器)：美国安JS-PD800-C用甲)：
有。

1.3方法
1.3.1窖泥菌群宏基因组的提取
用差法生物细胞沉淀［12)，采取反复冻融与试结合的方法，DNA,置于-20!保存；利用Qubit2.0DNA检测试剂盒对基因组DNA精确定量，以确定PCR反应加入的DNA量。

1.3.2PCR扩增及Miseq高通量测序
PCR扩增及Miseq高通量测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

利用Qubit2.0DNA检测试剂盒对回收的DNA精确定量，按照1：1的比例等量混后序。

等量混合时，每个样品的DNA量取10ng,最终上机测序的摩尔质量为20pmol。

对序得到的原始据进行质控过滤，最终获得可供分析的优质序列。

利用Usearch(Version5.2.236)按照97%的似度类生操作分类单元(operational tax­onomic,OTU),与核糖体数据库项目(ribosomal database pro­ject,RDP)比对得到物种类信息，并计算每个样品的香浓(Shannon)、超1(Chao1)指数等。

利用R(Version3.2)制作群落结构图［13■叫
1.3.3专性培养液的制备
在专性培养基中接入2'老熟窖泥，接种量为10%,35!静置培养，当甲烷生量〉40%时停止培养，发酵前后有机酸的含量。

1.3.4化学法窖泥驯化
将窖泥铲出鱼鳞状,均匀喷洒专性培养液，每口窖池的喷洒量为20L,喷洒位置为窖池底部和窖。

试验了3口窖池，为A、B、C，进行4发酵。

1.3.5物理法窖泥驯化
老熟窖泥的为颜色乌黑、有泡气、手感细软,有窖泥香;退化窖泥的为偏黄、手偏硬，缺少窖泥香问。

通过柔熟度、等［15)具有老熟窖泥的中窖泥与退化的窖底泥进行置换。

试
了3口窖池，为a、b、c，进行4发酵。

1.3.6有机酸含量的检测
用生化法结发酵液中有机酸的含量［呵。

1.3.7醇和酯含量的检测
窖泥驯化对的样，用
谱法分析酒样中的主要醇和酯成分［17)。

2结果与分析
2.1老熟窖泥原核微生物结构解析
2.1.1老熟窖泥原核微生物测序结果及多样性分析
对窖泥样序序列进行质控过滤后，对及细菌进行多样性分析，结果见表1〜表2。

表1老熟窖泥中古菌a-多样性分析结果
Table1Result of a-diversity-nalysis of archaea in aged pit mud 样品优质序列OTU
Shannon
指
Chao1
指
Coverage/
% 1248301406 1.661232495
2214281146 1.58823795
3228491336 2.061255995
表2老熟窖泥中细菌a-多样性分析结果
Table2Result of a-diversity analysis of bacteria in aged pit mud
样品优质序列OTU Shannon
指数
Chao31
指数
Coverage/
%
132******** 3.9022393694
23132141557 1.671528896
33170723473 4.341994094
由表1〜表2可知，各窖泥样本的Coverage均>94%,说明本次试验取样合理，结果能代表样本的真实情况。

Shanno1指数、Chaol指数是常用的描述群落物种多样性的指数，其中‘Shannon指数值越大，说明群落多样性越高；Chao1指数值越大,说明物种丰富度越高[18]0各窖泥样本以细菌微生物为主,其群落多样性及物种丰富度都高于古菌菌群。

2.1.2老熟窖泥原核微生物菌群结构分析
窖泥样本中原核微生物群落结构差异见图10
Methanocull&is Thermogymnomonas
Methanobact&ium
Methanosarcina
1 2 3■Clostridium
□Massiiia
□Petrimonas
□Syntrophomonas
□
□
□
图1基于属水平古菌(a)及细菌(b)菌群结构解析
Fig.1Communities structure analysis of archaea(a)and bacteria(b) based on genera level
由图la可知,3个窖泥样品的古菌群落主要有3类，分别为甲烷囊菌属(Methanoculleu^、热裸单胞菌属(Ihermo-gyrnnomona^^),甲烷杆菌属(Methanob^cteriuA。

其中，甲烷囊菌属为样本中数多的古菌，在3个窖泥样本中
依次为83.63%、88.05%和75.12%。

由图lb可知,3个窖泥样品的细菌群落中,梭菌属(Clostrid­ium是窖泥中的主要菌，分别为36.93%、86.35%和29.31%o其次,窖泥样本中还分布紫菌属(Petrimona^、互营单胞菌属(Syntrophomonas)及马西莉亚菌属(Massilia)等。

互营单胞菌属(Syntrophomonas)和梭菌属(Clostridium)是主要的细菌种属，常甲烷菌生，它
中生，有的还产生、丁有类,的要作用419-21]0
原核微生物群落结构结,菌属甲烷囊菌属是窖泥中的要菌群。

菌属中的菌
甲烷菌种互生，能
菌能,的主生有要
用422]。

而甲烷菌的甲烷生物主要是以为物产生甲烷，甲烷的67%,以H2/CO2甲烷甲烷的33%423]o窖泥原核微生物的主要，试验种以为主要的性，可为菌，可为甲烷菌的营物424]。

试验甲烷生
,甲烷>40%的用于窖泥。

2.2专性培养液有机酸分析
专性种2#窖泥进行发酵，对发酵前后的有含检测，结果见表3。

由表3可知，用专性基接种窖泥，专性中己酸含205.20mg/100mL)增加，乳含(69.73mg/100mL)减少。

结果表明，经专性基化后的窖泥菌群有增降乳功能，试验预期相符，符合窖泥化的趋425]o其中增多，可能基的分有关，影响需要结合的结果分。

mg/100mL
表3发酵前后专性培养液中有机酸含量的检测结果
Table3Determination results of organic acid content in obligate culture solution before and after fermentation
样品
有机酸
甲酸乙酸丙酸丁酸己酸庚乳酸
发酵前13.67±0.5141.86±1.35 1.25±0.0450.88±1.8868.42±2.01 3.16±0.11153.40±4.08发酵后 5.35±0.22107.50±4.21 2.97±0.1163.92±2.01205.20±6.28 5.92±0.1869.73±1.78
2.3化学法对窖泥驯化过程中酒质的影响
试验选取了3口窖池，好的性均匀地喷洒窖壁下层及部,待每轮结束取下层糟酷蒸N取样，测样中主要醇和酯的含，结果见表4。

由表4可知，每轮发酵结束后,由于生产过程涉及的工艺环节较多,主要指标变化不一，如酯的含先降后升。

但是，随化的推，从整趋来看，第3轮
跟踪结束，综合样中的酯含由292.13口*/100口1升高至422.65mg/100mL,乳酸乙酯含量由221.39mg/100mL 降至138.91mg/100mL,酯的变化趋性增己降乳的趋势较为一致。

表4化学法驯化酒样中醇和酯含量分析结果
Table4Analysis results of alcohols and esters contents in liquor samples domesticated by chemical method
mg/100mL 项目酸酯酸酯酸酯醇醇醇酸酯醇醇初始351.09312.6522.0819.1139.91 6.70408.6044.1218.96
A 第1轮456.37299.5624.1927.1963.337.48252.6867.3830.84第2轮375.93192.2327.2520.1367.917.45335.1057.4427.34第3轮506.53109.5125.3431.3048.869.81363.0258.0619.13始221.79156.0813.6630.9445.847.69199.0848.6416.87
B 第1轮194.85178.0013.0012.0424.52 3.83167.0024.457.61第2轮414.21277.6820.3841.2534.7110.09103.5547.5926.33第3轮301.83159.0025.6423.6779.608.49281.2378.4225.58始303.50195.4420.4640.6541.5510.66233.0861.3332.44
C 第1轮209.57273.4516.9837.2549.3710.97132.3953.1428.16第2轮263.58183.6017.9232.4349.2610.61276.3250.2327.59第3轮459.60148.2422.6331.7455.6610.35307.7055.7024.94
2.3物理法对窖泥驯化过程中酒质的影响
窖池下底部受黄水影响较大，易发生酸化及退化现象，而相对应的中层窖壁泥受黄水酸化影响较小，易于自我修复。

通过对车间某些窖池的观察发现，中部窖壁泥趋老熟特征较窖底泥明显。

试验通过柔熟程度、颜色等选取了具有趋老熟窖泥特征的中层窖壁泥与退化的窖底泥进行置换，以期使退化的窖底泥进行自我修复，控制窖底过度生酸。

窖底糟酷蒸t后,对酒样中主要的醇和酯含量进行测定,结果见表5。

表5物理法驯化酒样中醇和酯含量的分析结果
Table5Analysis results of alcohols and esters con t ents in liquor samples domesticated by physical method
mg/100mL 项目酸酯酸酯酸酯醇醇醇酸酯醇醇始248.25273.0013.0829.7226.158.51174.8742.6316.25第1轮209.23294.1910.5128.6535.497.47141.8237.8318.54第2轮240.37253.9315.7539.7129.5210.15274.5637.3827.84第3轮312.27200.008.3525.3134.43 6.00130.4335.2625.61始247.65136.6312.3124.8230.337.91125.2741.2716.67第1轮176.43355.1913.4533.9934.017.43164.0132.9927.79第2轮302.00435.6214.9348.2025.2011.88132.5634.3117.96第3轮292.55183.6217.1725.0246.228.24245.5150.9222.52始311.57149.8515.6032.2550.828.52186.7599.1117.54第1轮371.82319.5338.5027.8857.477.54255.8668.9917.43第2轮288.56290.3216.1330.3555.897.88250.2860.1416.56第3轮301.28196.8320.5836.6260.788.02233.3658.7515.59
由表5可知，己酸乙酯及乳酸乙酯含量在前两轮分别现了程度的下及，可与退化窖泥的自我修复有关。

第3轮的酒样，酸乙酯含量，而乳酸乙酯含量下降，己酸乙酯与乳酸乙酯的比例更加协，醇中醇含量，酒样酒。

试验显，通过量的窖泥特，的置换可以酒的，窖泥化了的。

3结论
窖泥在酒过程中的，窖泥化，生，
窖泥生样，化老熟窖泥生窖池生酸，置换化窖泥。

试验明，两
化窖泥的的。

中，化的
更加明显，酒样中己酸乙酯含量提高44.67%,乳酸乙酯含
量下降37.25%；而物理置换法驯化过程较为缓慢。

由于物理置换不涉及任何外源物质添加等生产安全问题，可进一步完善置换窖泥相应参数指标，更好地指导窖泥养护和生产°在实际生产过程中，靠岁月不断积累起来的窖泥微生态系统仍然很难复制，并且每的窖泥态不可完全一，窖泥的养窖的具体情况来制定相应的养窖方式，将研究不断生产实相结合,了解每窖池的发酵生酸情况及窖泥的感官变化等，制定的养窖°
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