第二节扩增片段长度多态性（amplifiedfragmentlength
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度 过低则降低反应产量。
四种dNTP必须浓度相等
5. Mg2+
Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。
0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系，一般常用 1.5mmol/L终浓度。
Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、 EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
– 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） -扩增10Kb需延伸至15min • 延伸时间过长会导致非特异性扩增。 • 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
4.循环次数
主要取决于模版DNA的浓度。 一般为25-35次。 次数过多：扩增效率降低，错误掺入率增加。
5.PCR技术的特点
•High sensitivity---灵敏度高 •High specificity---特异性高 •Template DNA purity and integrity
第二节 扩增片段长度多态性 （amplified fragment length
polymporphism, Amp-FLP）
一.扩增片段长度多态性概述 二.聚合酶链式反应
三.常染色体STR分型
四.Y染色体STR分型
第三节 扩增片段长度多态性
（amplified fragment length polymporphism, Amp-FLP）
＊二.PCR反应体系
• Taq DNA聚合酶(Taq DNA polymerase )
• 引物(primer) • dNTP(A、T、C、G) • 模板(template) • Mg2+（PCR buffer）
标准的PCR反应体系（ 50l ）
4种dNTP混合物 各100 mol/L（A、C、T、G）
1.Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）
水生栖热菌(thermus aquaticus,Taq)的DNA聚合酶。 ①5’3’DNA聚合酶活性； ②无3’5’外切酶活性，没有引物3’ 端错配碱基的校正功能， 35轮循环有0.25%错配，与原始模板 有差别。
2. 引 物（primer）
• PCR的特点
Taq酶 Antisense Primer
Sense Primer
Taq酶
50-60 ℃ 72℃
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
The first cycle
72℃
PCR的基本原理 • Ta•q
PPCCRR反过应程条件95℃
• PCR的特点
Taq
＊一.PCR原理（ PCR principle ）
在体外，以一对人工合成的特异性寡核苷酸 为引物，四种脱氧核苷酸为底物，以待测目的 DNA为模板，在DNA聚合酶的催化作用下，通过高 温变性、低温退火、中温延伸的温度循环，选择 性扩增目的DNA片段，经过30个循环周期后，目 的DNA片段达到百万倍的扩增。
3’
5’
A B
primers
dNTP
Taq DNA polymerase
Mg2+ Mg2+ Mg2+ Mg2+ Mg2+Mg2+
Buffer containing magnesium
1.Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）
最适温度：72℃， 半衰期：92.5℃130min ；95℃ 40min ； 97.5℃ 5—6min。 酶量增加使反应特异性下降; 酶量过少影响反应产量。
95℃
Denaturation (heat to 95oC)
DNA template
Anneal with primers (lower to 50-60℃)
Antisense Primer
95℃
Sense Primer
50-60℃
ExtPeCnRsi的on基(in本cre原ase理to
70o••C)PPCCRR反过应程条件
The PCR procedure Denaturation （变性）---高温 Annealing （复性）---低温 Extension （延伸）---中温
The Reaction
PCR tubes
Thermal Cycler
DNA Denaturation（DNA变性）
• 通过加热（94 ℃ ）使模板DNA双链间氢键 断裂，双链解离形成两条单链DNA的过程。
3.模 板(template)
单、双链DNA均可。模板的要求： （1）不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑
制剂、DNA结合蛋白（组蛋白）等杂质。 （2）模板适量。（模板浓度过高会导致反应的
非特异性增加，浓度过低则降低反应产量）。
4. dNTP
dNTP浓度取决于扩增片段的长度,一般终 浓度：dNTP浓度在20～200 mol/L
• 取决于引物的长度、碱基组成（GC含量）及 其浓度，还有靶序列的长度。
• 退火温度是影响PCR特异性的重要因素： 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合; 降低温度可增加反应的灵敏性。
• 复性时间:一般为30～60sec，足以使引物与 模板之间完全结合.
3.延伸温度和时间
延伸温度：一般在70～75℃之间，常用温度为72℃。 此时TaqDNA聚合酶活性最高。 延伸时间：靶序列长度
教学内容和目的要求：
1.掌握扩增片段长度多态性概念、分型原理和技术 2.掌握聚合酶链式反应 3.掌握常染色体STR分型。 4.掌握Y染色体STR分型。
一.扩增片段长度多态性概述
（amplified fragment length polymporphism, Amp-FLP）
采用PCR技术对模板DNA的等位基因进行特异性扩增， 通过电泳直接检测其扩增产物的长度所呈现的长度多 态性。 目前用荧光标记引物对多个STR基因座扩增片段长 度多态性复合扩增检测方法，已成为对生物检材进行 个人识别和亲权鉴定的主要方法。
一.扩增片段长度多态性概述ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
（amplified fragment length polymporphism, Amp-FLP）
扩增片段长度多态性分析技术： （ Amp-FLP 分析技术）
PCR-VNTR
PCR-STR
二. 聚合酶链式反应
polymerase chain reaction PCR
教学内容和目的要求：
What is PCR ?
• PCR
(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)
Polymerase---P Chain---C Reaction---R
Kary B Mullis
PCR was invented in 1983 by Dr. Kary B Mullis, for which he received the Nobel Prize in Chemistry in 1993.
The second cycle
Taq
65℃
Taq
72℃
DNA template
20－30 cycles
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
DNA 2
形 成
条变 单性 链
DNA单链 与引物复性
子链延伸 DNA加倍
Amp-FLP分析技术早期应用于小卫星VNTR基因座的分型。因为 TaqDNA聚合酶的链延伸能力限制，扩增片段长度多在2000bp 以下，但法医学实践中遇到的法医物证检材多受到外界环境 的影响，DNA变性、降解，不能获得完整的人类DNA模板，所 以不能有效地进行VNTR基因座的分型。
二.PCR-VNTR
DNA Annealing（DNA退火）
又称DNA复性，将反应体系降温（60 ℃ ） ，引物与单链模板DNA按照碱基互补配对的 原则重新形成模板-引物杂化双链的过程。
DNA Extension（DNA延伸）
• DNA聚合酶在适当温度条件下（72℃）催化 4种dNTP原料按照碱基互补配对原则从引物 的3’末端开始渗入，沿模板5’3’方向延伸 ，合成一条新的DNA链的过程。
（Variable number tandem repeats,VNTRs）
2.PCR-VNTR 分型应用的局限性：
（2）VNTR基因座的等位基因片段较大，不易扩增，检 出率低。加上不同等位基因间片段长度相差较大，容 易发生等位基因脱逸，将杂合子误判为纯合子。
二.PCR-VNTR
（Variable number tandem repeats,VNTRs）
人 工 合 成 的 寡 核 苷 酸 序 列 , 与 靶 DNA 片 段两侧翼的序列互补。
引物序列限定了PCR产物的长度和特异 性。引物浓度一般为0.1～ 0.5mol/L 。
例如IL-3 ： 5’GCTCCATGA---------TGAGTCCAA 3’—正链
--ACTCAGGTT 5’—负链 • 上游引物：与其5’→3’端的序列相同 5'-GCT CCA TGA -3' • 下游引物： 相应互补链5'→3'序列相同
＊掌握PCR的原理 ＊掌握PCR的反应体系和方法 ＊熟悉PCR在法医学的应用
聚合酶链式反应 polymerase chain reaction, PCR 一种模拟人体DNA半保留复制原理，在体外扩
增特异性目的DNA片段的技术，经过PCR，可
在数小时内，使目的DNA片段获得百万个的拷
贝，便于后续的分析和检测。
基本分型技术与PCR-STR相似，在法医学领域 目前已经没有应用了。
5'-TTG GAC TCA -3‘
靠近5’上游Primer与双链DNA正链相同，3’下 游Primer与负链相同。
引物设计原则：
（1）序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。 （2）引物长度以15-30 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。 （6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。
三.热循环参数对PCR的影响 变性温度与时间 退火温度与时间 延伸温度与时间 循环次数
1.变性温度与时间
一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性 ——若低于93℃则需延长时间 ——但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性 有影响。
• 此步若不能使靶基因模板完全变性，就会导致 PCR失败。
2.退火(复性)温度与时间
The PCR principle
PCR is just like DNA replication in vivo.
a pair of oligonucleotides --primers（引物） dNTP -- substrate（底物） Target DNA -- template（模板） Taq DNA polymerase--enzyme（酶）
22 DNA双螺旋
重复1～3步 25～30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
PCR的一般过程： 预变性(93-95C,2-5m)
变性(93-95C,30s)
退火
(25-35)
延伸
总延伸
(50-70C,30s) (72C,30-60s) (72C,7m)
经过30次的循环, 扩增的DNA片段可达100万倍以上。
requirements is not high---对模板 DNA的纯度及完整性要求不高 •Species specificity---种属特异性好 •Simple, fast---简便、快速
二.PCR-VNTR
（Variable number tandem repeats,VNTRs） 1.可变数目串联重复序列
引物
各10～50pmol（上游引物、下游引物）
模板DNA
0.1～1 g
Taq DNA聚合酶 1.25u
缓冲液 Mg2+
1.5mmol/L
KCl
50mmol/L
Tris-HCl(Ph8.4) 10mmol/L
0.001%明胶或牛血清蛋白
What’s in the Tube
5’
3’
Target DNA
• 重复单位长度：15-30bp • 序列总长度： 100bp-20kb。
基因座A(VNTR)
二.PCR-VNTR
（Variable number tandem repeats,VNTRs）
2.PCR-VNTR 分型应用的局限性：
（1）腐败、降解检材成功率低
（Corruption, degradation of samples with low success rate）
四种dNTP必须浓度相等
5. Mg2+
Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。
0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系，一般常用 1.5mmol/L终浓度。
Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、 EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
– 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） -扩增10Kb需延伸至15min • 延伸时间过长会导致非特异性扩增。 • 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
4.循环次数
主要取决于模版DNA的浓度。 一般为25-35次。 次数过多：扩增效率降低，错误掺入率增加。
5.PCR技术的特点
•High sensitivity---灵敏度高 •High specificity---特异性高 •Template DNA purity and integrity
第二节 扩增片段长度多态性 （amplified fragment length
polymporphism, Amp-FLP）
一.扩增片段长度多态性概述 二.聚合酶链式反应
三.常染色体STR分型
四.Y染色体STR分型
第三节 扩增片段长度多态性
（amplified fragment length polymporphism, Amp-FLP）
＊二.PCR反应体系
• Taq DNA聚合酶(Taq DNA polymerase )
• 引物(primer) • dNTP(A、T、C、G) • 模板(template) • Mg2+（PCR buffer）
标准的PCR反应体系（ 50l ）
4种dNTP混合物 各100 mol/L（A、C、T、G）
1.Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）
水生栖热菌(thermus aquaticus,Taq)的DNA聚合酶。 ①5’3’DNA聚合酶活性； ②无3’5’外切酶活性，没有引物3’ 端错配碱基的校正功能， 35轮循环有0.25%错配，与原始模板 有差别。
2. 引 物（primer）
• PCR的特点
Taq酶 Antisense Primer
Sense Primer
Taq酶
50-60 ℃ 72℃
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
The first cycle
72℃
PCR的基本原理 • Ta•q
PPCCRR反过应程条件95℃
• PCR的特点
Taq
＊一.PCR原理（ PCR principle ）
在体外，以一对人工合成的特异性寡核苷酸 为引物，四种脱氧核苷酸为底物，以待测目的 DNA为模板，在DNA聚合酶的催化作用下，通过高 温变性、低温退火、中温延伸的温度循环，选择 性扩增目的DNA片段，经过30个循环周期后，目 的DNA片段达到百万倍的扩增。
3’
5’
A B
primers
dNTP
Taq DNA polymerase
Mg2+ Mg2+ Mg2+ Mg2+ Mg2+Mg2+
Buffer containing magnesium
1.Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）
最适温度：72℃， 半衰期：92.5℃130min ；95℃ 40min ； 97.5℃ 5—6min。 酶量增加使反应特异性下降; 酶量过少影响反应产量。
95℃
Denaturation (heat to 95oC)
DNA template
Anneal with primers (lower to 50-60℃)
Antisense Primer
95℃
Sense Primer
50-60℃
ExtPeCnRsi的on基(in本cre原ase理to
70o••C)PPCCRR反过应程条件
The PCR procedure Denaturation （变性）---高温 Annealing （复性）---低温 Extension （延伸）---中温
The Reaction
PCR tubes
Thermal Cycler
DNA Denaturation（DNA变性）
• 通过加热（94 ℃ ）使模板DNA双链间氢键 断裂，双链解离形成两条单链DNA的过程。
3.模 板(template)
单、双链DNA均可。模板的要求： （1）不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑
制剂、DNA结合蛋白（组蛋白）等杂质。 （2）模板适量。（模板浓度过高会导致反应的
非特异性增加，浓度过低则降低反应产量）。
4. dNTP
dNTP浓度取决于扩增片段的长度,一般终 浓度：dNTP浓度在20～200 mol/L
• 取决于引物的长度、碱基组成（GC含量）及 其浓度，还有靶序列的长度。
• 退火温度是影响PCR特异性的重要因素： 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合; 降低温度可增加反应的灵敏性。
• 复性时间:一般为30～60sec，足以使引物与 模板之间完全结合.
3.延伸温度和时间
延伸温度：一般在70～75℃之间，常用温度为72℃。 此时TaqDNA聚合酶活性最高。 延伸时间：靶序列长度
教学内容和目的要求：
1.掌握扩增片段长度多态性概念、分型原理和技术 2.掌握聚合酶链式反应 3.掌握常染色体STR分型。 4.掌握Y染色体STR分型。
一.扩增片段长度多态性概述
（amplified fragment length polymporphism, Amp-FLP）
采用PCR技术对模板DNA的等位基因进行特异性扩增， 通过电泳直接检测其扩增产物的长度所呈现的长度多 态性。 目前用荧光标记引物对多个STR基因座扩增片段长 度多态性复合扩增检测方法，已成为对生物检材进行 个人识别和亲权鉴定的主要方法。
一.扩增片段长度多态性概述ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
（amplified fragment length polymporphism, Amp-FLP）
扩增片段长度多态性分析技术： （ Amp-FLP 分析技术）
PCR-VNTR
PCR-STR
二. 聚合酶链式反应
polymerase chain reaction PCR
教学内容和目的要求：
What is PCR ?
• PCR
(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)
Polymerase---P Chain---C Reaction---R
Kary B Mullis
PCR was invented in 1983 by Dr. Kary B Mullis, for which he received the Nobel Prize in Chemistry in 1993.
The second cycle
Taq
65℃
Taq
72℃
DNA template
20－30 cycles
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
DNA 2
形 成
条变 单性 链
DNA单链 与引物复性
子链延伸 DNA加倍
Amp-FLP分析技术早期应用于小卫星VNTR基因座的分型。因为 TaqDNA聚合酶的链延伸能力限制，扩增片段长度多在2000bp 以下，但法医学实践中遇到的法医物证检材多受到外界环境 的影响，DNA变性、降解，不能获得完整的人类DNA模板，所 以不能有效地进行VNTR基因座的分型。
二.PCR-VNTR
DNA Annealing（DNA退火）
又称DNA复性，将反应体系降温（60 ℃ ） ，引物与单链模板DNA按照碱基互补配对的 原则重新形成模板-引物杂化双链的过程。
DNA Extension（DNA延伸）
• DNA聚合酶在适当温度条件下（72℃）催化 4种dNTP原料按照碱基互补配对原则从引物 的3’末端开始渗入，沿模板5’3’方向延伸 ，合成一条新的DNA链的过程。
（Variable number tandem repeats,VNTRs）
2.PCR-VNTR 分型应用的局限性：
（2）VNTR基因座的等位基因片段较大，不易扩增，检 出率低。加上不同等位基因间片段长度相差较大，容 易发生等位基因脱逸，将杂合子误判为纯合子。
二.PCR-VNTR
（Variable number tandem repeats,VNTRs）
人 工 合 成 的 寡 核 苷 酸 序 列 , 与 靶 DNA 片 段两侧翼的序列互补。
引物序列限定了PCR产物的长度和特异 性。引物浓度一般为0.1～ 0.5mol/L 。
例如IL-3 ： 5’GCTCCATGA---------TGAGTCCAA 3’—正链
--ACTCAGGTT 5’—负链 • 上游引物：与其5’→3’端的序列相同 5'-GCT CCA TGA -3' • 下游引物： 相应互补链5'→3'序列相同
＊掌握PCR的原理 ＊掌握PCR的反应体系和方法 ＊熟悉PCR在法医学的应用
聚合酶链式反应 polymerase chain reaction, PCR 一种模拟人体DNA半保留复制原理，在体外扩
增特异性目的DNA片段的技术，经过PCR，可
在数小时内，使目的DNA片段获得百万个的拷
贝，便于后续的分析和检测。
基本分型技术与PCR-STR相似，在法医学领域 目前已经没有应用了。
5'-TTG GAC TCA -3‘
靠近5’上游Primer与双链DNA正链相同，3’下 游Primer与负链相同。
引物设计原则：
（1）序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。 （2）引物长度以15-30 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。 （6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。
三.热循环参数对PCR的影响 变性温度与时间 退火温度与时间 延伸温度与时间 循环次数
1.变性温度与时间
一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性 ——若低于93℃则需延长时间 ——但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性 有影响。
• 此步若不能使靶基因模板完全变性，就会导致 PCR失败。
2.退火(复性)温度与时间
The PCR principle
PCR is just like DNA replication in vivo.
a pair of oligonucleotides --primers（引物） dNTP -- substrate（底物） Target DNA -- template（模板） Taq DNA polymerase--enzyme（酶）
22 DNA双螺旋
重复1～3步 25～30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
PCR的一般过程： 预变性(93-95C,2-5m)
变性(93-95C,30s)
退火
(25-35)
延伸
总延伸
(50-70C,30s) (72C,30-60s) (72C,7m)
经过30次的循环, 扩增的DNA片段可达100万倍以上。
requirements is not high---对模板 DNA的纯度及完整性要求不高 •Species specificity---种属特异性好 •Simple, fast---简便、快速
二.PCR-VNTR
（Variable number tandem repeats,VNTRs） 1.可变数目串联重复序列
引物
各10～50pmol（上游引物、下游引物）
模板DNA
0.1～1 g
Taq DNA聚合酶 1.25u
缓冲液 Mg2+
1.5mmol/L
KCl
50mmol/L
Tris-HCl(Ph8.4) 10mmol/L
0.001%明胶或牛血清蛋白
What’s in the Tube
5’
3’
Target DNA
• 重复单位长度：15-30bp • 序列总长度： 100bp-20kb。
基因座A(VNTR)
二.PCR-VNTR
（Variable number tandem repeats,VNTRs）
2.PCR-VNTR 分型应用的局限性：
（1）腐败、降解检材成功率低
（Corruption, degradation of samples with low success rate）