日本医蛭 hirudin-like factor-HN 基因克隆及表达模式研究

第37卷第3期2021年3月
贵州师范学院学报
Journal of Guizhou Education University Vol. 37 No. 3Mae . 2021
H 本医蛭 hirudin - like factor - I+ 基因
克隆及表达模式研究
范发红打康雄城打谢 新1,程搏幸，刘 飞2
(1.贵州师范学院生物科学学院，贵州贵阳550018 ；2.盐城工学院海洋与生物工程学院，江苏盐城224000)
摘要：目的：克隆日本医蛭(Hirudr ”kpo ”ka )hkudk-J"efaCrr -1+(IKL - I+)基因并分析该基因时空 表达模式。

方法:收集未摄食血餐时期水蛭的唾液腺、肠、皮肤和不同摄食时期的唾液腺组织。

根据HKL-
H+的cDNA 序列设计特异引物，克隆HKL - H+基因的DNA 序列,荧光定量分析HKL - H+基因在不同组
织和不同摄取时期的表达模式。

结果：成功克隆得到HKF-H+基因的DNA 序列，长度为662 bp ,包含4个
外显子和3个内含子，该基因在水蛭摄食后的表达量呈现先上升后下降的趋势。

结论：HKF-H+基因结构 相对保守,摄食血餐后该基因表达量显著升高，可为下一次摄食血餐储备抗凝蛋白。

关键词：日本医蛭;HKF-H+基因；基因结构;表达特性中图分类号：S865.9
文献标识码:A 文章编号：1674 -7798(2021)03 -0019 -07
Cloning and expression pattere of Hirudin - like factor gene by
Hirudin - Like factor , Hirudo nipponicc
FAN Fa-hong 1 ,KANG Xiong-xiao 1 ,XIE Xin 1, CHENG Bo-xing 1* ,LIU Fei 2
(1. School of Biological Sciences , Guizhou Education University, Guiyang, Guizhou , 550018 ；
收稿日期：2020 -01 -20
基金项目：贵州师范学院大学生科研
“日本医蛭HcdP-HN 基因启动子区多态性及生物信息学研究"(2019DXS181 )；贵州师范学
院2020年 校级博士课题“水蛭 Hikdic - HN 基因表达机制研究” (2020BS004))
作者简介:范发红(1998 -),，贵州六盘
，贵州师范学院在读本科生，研究方向：中药资
发与利用)
*通讯作者:程搏幸(1985 -),，江苏镇江人，博士，贵州师范学院副 ，研究方向：中药资 发与利用)
2. School of Marine and Bioengineering , Yancheng Institute of Technology , Yancheng, Jiangsu, 224000)Abstract : Objective : To clone the Hirudm - like factor - H+ ( HKL - H+) gene of Hirudik Nippomcc , and
analyze its spatio - temporal e xpression pattern. Method : The salivary glands , intestine , skin and salivery gland
tissues of leeches during the non - feeding period were collected. Specific primers were designed according te the
cDNA sequencc of THL - HN, the DNA sequencc of ULF - HN gene was cloned , and the expression law of HKL -
HN gene in diOerent tissues and diOerent uptake periods was quantitatively analyzed by Uuorescence. Result : The
DNA sequencc of HLF - HN gene was successful ty cloned with a length of 662 bp , containing 4 exons and 3 inf
trons. The expression of thie gene increased first and then decreased after leech feeding. Conclusion : HLF - HN
gene has a relativel conservative structure , and its expression level is sianificanUy increased after blood meal in- iake, whoch mayeeseeeeaniocgagu anipegieon egeiheneiib ggd mea%oniake.
Key words : Hkudo ”ppo ”pa ； HLF - HN gene ； genetio structure ； expression characteristics
贵州师范学院学报2021年第3期
日本医蛭(Hirudo nipponica)生活于水田、沟渠、沼泽等潮湿陆地和淡水环境，主要以吸食畜类动物血液为生[1_2])日本医蛭收录于《中国药典》(2020年版)[3],是水蛭药材基源动物之一。

水蛭及其制剂具有抗凝血、抗血栓、降血脂等功效⑷，对微循环[5]&抑制肿瘤增殖及脑部缺氧具有改善作用⑷,可作为冠状动脉粥样硬化心脏病、急性心肌梗死等心脑血管疾病的特效药[7'8],在整形外科等领域的应用也颇为广泛[9])
水蛭唾液腺分泌的大量活性成分供其吸血时抑制寄主防御系统的抵抗(止血、炎症等)，以便顺利完成摄食血餐，该类活性成分主要包括:水蛭素、抑制血小板聚集剂、降解血栓蛋白、血管舒张剂、抗炎剂等[10])1884年在欧洲医蛭唾液腺分泌物中发现的具有抗凝血酶活性物质一水蛭素，是迄今为止被发现的最强且具特异性的天然抑制凝血酶活性物质[11'14],随后HPudP-H+'15(、MuPudp'1句、Hae/adin'17(、Grantin'1刃、
TheromiP-19(等水蛭素类活性成分陆续在其它水蛭唾液中发现。

吸血类动物通过摄食血餐引起自身生理变化,诱导了抗凝剂、消化蛋白、免疫调节物质转录本的上调表达[20])本课题组已在日本医蛭唾液腺转录组中筛选到HPudP-li.Ce factor-H+(HKL -H+)基因，该蛋白抑制凝血酶活性已被验证，但其基因结构和表达规律鲜见报道。

本试验研究HKF-H+基因结构、唾液腺中HKL-H+基因在不同摄食时期的表达规律和不同组织中的基因表达量,以期为深入了解水蛭摄食特性及水蛭药材应用开发提供科学依据。

1材料与方法
1.1材料与试剂
日本医蛭(H.nipponica)采集于贵州省荔波县，以健康的、体表无伤痕的水蛭(0.5±0-05g)作为研究对象。

DNAise Reagent基因组DNA提取试剂、RNAise Plus总RNA提取试剂、Prime-Script™RT reagent Kit with gDNA Eraser cDNA合成试剂盒、TB Green®Premic Ex Taq™"(Tii 2RNase Plus)荧光定量试剂盒等购于宝生物工程(大连)有限公司；Phanta Max Super-FmeUty DNA Polymerase高保真酶、FastPure®Gd DNA Ex­traction Mini Kit胶回收试剂盒等购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司；pEASY-Blunt Cloning Kit平端克隆载体试剂盒购于北京全式金生物技术有限公司。

克隆引物和荧光定量引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2仪器与设备
PCR仪、qPCR仪:BI0-RAD；XW-80A微
:上海泸西分析仪器厂有限公司；立式压力蒸汽灭菌器:上海申安医疗器械厂;超净工作台:苏净集团苏州安泰空气技术有限公司;电泳仪:北京市六一仪器厂；Microfuga20R离丿卜机：Beckman Coulter;ZF-268全自动凝胶成像分析系统:上海嘉鹏科技有限公司；电子天平:凯丰集团有限公司；台式恒温震荡器:苏州市培英实验设备有限公司;霉菌培养箱:上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.3材料处理
试验中以禁食至少30天的水蛭作为试验材料,使用新鲜血液作为饵料投喂水蛭。

摄食血餐处理后，将不同摄食时期的水蛭在冰上无菌解剖，收集不同摄食时期的水蛭唾液腺(Sai),分别为:未摄食时期的唾液腺(HNS0)、正在摄食时期的唾液腺！HNSing)、摄食后1天的唾液腺(HNS1)、摄食后2天的唾液腺！HNS2)、摄食后3天的唾液腺(HNS3)、摄食后5天的唾液腺！HNS5)、摄食后7天的唾液腺(HNS7)。

按照相同方法解剖未摄食时期水蛭的皮肤(Ski)、性腺(Sea)&肠(Ok)。

将上述不同摄食时期的唾液腺和各组织经液氮速冻后保存于-80C冰箱。

1.4方法
1-4.1核酸提取
(1)DNA的提取
按照DNAise Reagent基因组DNA提取试剂操作说明书提取Ski组织的基因组DNA,使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性，供HKL-H+基因克隆使用。

日本医蛭hirudin-like factor-I+基因克隆及表达模式研究
（2）总RNA的提取
按照RNAisc Plus总RNA提取试剂操作说明书提取不同摄食时期水蛭唾液腺！HNS0、HNSing、HNS1&HNS2、HNS3、HNS5、HNS7）及不同组织（Ski、Sea、Ink）的总RNA,将各组质量合格的总RNA通过PvmeScvpt T M RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒反转录为cDNA,供荧光定量检测IKF-IV基因在不同摄食时期、不同组织中的表达量使用。

1.4.2IKF-I+基因的克隆
根据IKL-1+基因cDNA序列（本课题组前期试验结果），运用SnapGena Ver3.2.1软件设计基因组扩增引物（见表1））以基因组DNA为模板进行IKL-1+基因PCR扩增，先后加入25$L 的2x Phanta Max Buffes,1$L的dNTP Mix,各2 $L的正向引物、反向引物，1$L的Phanta Max Supas-Fidelity DNA Polymerase,5$L的基因组DNA,再加入14$L的ddH20补足50$L反应体系。

反应程序为：95°C预变性3min；95oC变性15s,58°C退火15s,72°C延伸30s,循环35次；72°C彻底延伸5min。

制作1.5%琼脂糖凝胶, 120V,30min电泳检测扩增结果。

按照FastPure®Gel DNA Extraction Mini Kit 胶回收试剂盒操作说明书进行胶回收，将纯化后的条带按照pEASY-Blunt Cloning Kit平端克隆载体试剂盒操作说明书接连到p4$SO-Blunt质粒上并转入Top10大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆，菌液PCR验证合格后，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

IKF-IV基因序列与cDNA序列进行比对，确定基因内含子与外显子序列。

1.4.3不同组织、不同摄食时期唾液腺中IKL-1+基因表达模式的分析
根据IKL-1+基因cDNA序列，使用金斯瑞引物设计工具网站（http：//www.genscipt.cam/ tools/weal-time-pcs-tagman-pvmar-design-tool）设计IKL-1+基因荧光定量引物（见表1））分别以不同摄食时期的唾液腺（HNS0、HNSing、HNS1、HNS2、HNS3、HNS5、HNS7）和不同组织（HNS0、Ski、Sea、Ink）的cDNA为模版，以&-$c-t-基因作为内参基因。

利用AB【StepOna Real-Tioe PCR检测IKL-I+基因相对表达量，根据TB Green®Premia Ex Taq™n（Tii RNase Plus）荧光定量试剂盒操作要求，分别加入10 $L的TB Green Pre/ir4q Taq n（Tii RNase Plus）（2x）,2咲的cDNA,各0.8$L正、反向引物，0.4$L的ROX Referenca Dya（50x），加入RNase Free dH2O6$L补足20$L的反应体积。

按照试
反应程序,每个反应重复3次，结后解曲线分析）运用公式2-AAC,e韋IKF-I+基因在不同组织和不同摄食时期唾液腺的表达量,使用Exc<l2016软件
分析）
表1日本医蛭IKL-I+基因克隆及荧光定量所用引物
引物名称列（5‘一3，）备注
IKF-IV-F GCAATATTTCCGACTGGG
基因组扩增引物
IKF-IV-R TTAATCATACTCATCGTA
qHLF-HN-F CTGCATGTCTCAAGCTCAGC
荧光定量引物
gIKF-IV-R ACGATGCATTTCTTTGGCGG
actir-F ATTGGGCAGATCGTGAGC
荧光定量引物（内参基因）actir-R GAAGTGGATGCGAGGGTAG
2结果与分析
2.1日本医蛭血F-IV基因组的克隆与分析使用DNAosoReagent取日医蛭因DNA,取3咽用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA质量。

如图1A所示，日本医蛭基因组DNA条带大于5000bp,条带清晰完整，无拖尾现象，满足IKL-IV基因克隆要求。

贵州师范学院学报2021年第3期
A
1M
bp
5000
3000
2000
1500
1000
750
500
250
100
B
图1日本医蛭基因组DNA和HLF-HN基因组扩增产物电泳图
注：M,DNA Marker；A,0本医蛭基因组DNA#B,HLF-HN基因组扩增产物"
以日本医蛭皮肤基因组DNA作为模板，运用引物HLF-HN-F和HLF-HN-（进行PCR扩增,扩增片段长度与理想值一致（如图1B）,与HLF-HN基因cDNA序列比对发现,HLF-HN基因序列长度为662bp,其中包含4个外显子和3个内含子,并且在子和外显子交界处存在保守区域，内含子5'端均以“GT，起始，3'端以“AG”结束（见图2），符合“GT-AG，原则。

'21（
|ATGTTTTCTCTGAAAGTGTTCGTCGTCTTGTTGGCAGTTTGCATCTGCArGTCTCAAGCT|60bp gGTGAGTTTGACTCGATCTTTACTAAAATTGGCAATAAATGCTAGACAGTAGTGCATAAA120bp GACATTTACTTACTGTCGTAGTTGATGTACTGGTTTTATTGCAG|AGCGTTTCAAAGAArQ iso bp |CTCAGAGAGTAATCCAACCCCATGCTTGTGCG a A|GTAAGTATGAGTGGTTATTACACAG239bp ATCCAGGTCTTCTTAACCACTATAAATAArTGTTATGTTATGTTAATTATTTAAAATTACGG301bp TTTCCGTCATTTCAAATAAGGCAAATAGTTGAAACGTTGATTTTCAG|AArGGTAATCTCi1361bp iGTACTTCTGGTAACACTTGTGATCTGGGCCCGCCAAAGAAATGCArCGTAAAACl GTAAr«o bp GATTTCTATAATTTATAACATGAATATTAAACTATAACAATATTACATATTACATTAGGCTAA483bp AAATTACTATTTACTATTACGArTTAGTAArTTCTAGAAAAAAGCGCTTTCCATGCATArTT545bp GAATAMAACATTTAAGTAGCTTACAAAGAGATTTGTGAAACATTTATTTTTAAATTTAAG就bp lAACCTTCCATCTCGGAGAATAAAGAAAGCAAGTCTGArTACGATGAGTATGATTAAl”2bp
图2HLF-HN基因结构
注：方框序列为外显子,框外序列为内含子；粗体代表启始密码子和终止密码子;阴影部分代表内含子和外显子拼接位点。

在医蛭科其它水蛭中(Hkudo/edppals、Hkudo verbaka、Hkudo orpktal)也存在HLF基因，均有保守的4个外显子和3个内含子结构（见图3）。

外显子长度相对保守，外显子1的长度无
日本医蛭hPudP-like factor-H2V基因克隆及表达模式研究
，均61bp,显子2在HKL1shorT和long 中是47bp夕卜，其余均为50bp,外显子3长度范围在64-76bp之间,外显子4长度范围较大，最短的只有5bp,最长的为83bp。

内含子长度相对变化较大，日本医蛭HKL-HV基因的内含子2长度最长，达到134bp,其它水蛭HKL基因中内含子2为71bp76bp,而日本医蛭HKL-H+基因内含子3最,仅为204bp,最长的达到522bp。

从基因结构上推测,HKL-H+基因外显子结构相对保守，变化主要体现在外显子4和内含子上，尤其是子3上，说明HKL-H+基因的进化主要在内含子3上发生。

H.nipponica H.medicinalis
H.verbana
H.orientalis
HLF-HN
HLF\short
HLF\long
HLF2
HLF\short
HLF4a
HLF4b
HLF1short
HLF1long
HLF3short
HLF3long
20i^
^
38^
h
61116
507664
图3水蛭HKF-H+基因结构的比较[22-23]
注：实线代表内含子；矩形代表外显子。

2.2日本医蛭血F-HV基因表达规律的分析
冰上无菌解剖未摄食时期日本医蛭的不同组织（Ski、Sea、Ink、HNS0）和不同摄食时期唾液腺（HNSing、HNS1&HNS2、HNS3、HNS5、HNS7）,分别提取各样品的总RNA,使用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，总RNA条带明亮且清晰（见图4）,总RNA完整性较好，反转录为cDNA。

以&-Actic基因作为内参基因，利用ABI StepOna Reai-Tita PCR分析HKL-H+基因时空表达模式（见图5）。

未摄食时期HKF-H+基因转录本在日本医蛭唾液腺中表达量显著高于其它组织（见图5A）,该结果与HPudP-H+基因的空间表达规律一致,都在唾液腺组织中特意表达'15（。

摄食血餐处理后,HKL-H+基因的相对
表达量立刻小幅下降，并又在摄食后1天达到最高值后再逐渐下降（见图5B）o HPudP-H+基
贵州师范学院学报2021年第3期
因相对表达量在摄食处理后也出现了下降趋势，1天才开始出现相对表达量下降趋势［15］)正在摄食时表达量未发生明显变化，而在摄食后
图4日本医蛭总RNA电泳检测
注：泳道1,HNS0；泳道2,HNS1；泳道3,HNS2；泳道4,HNS3；泳道5,HNS5；泳道6,HNS7；泳道7, HNSing；M,marker(DL2000)；泳道8,Ski；泳道9,Ink；泳道10,Sex o
注:A：不同组织中ILF-IN基因表达模式；B：不同摄食时期唾液腺中ILF-IN基因表达模式"
与日本医蛭不同的是，医蛭科I”f”e-a摄食血餐后,Ikudk基因相对表达量呈先上升后下降的趋势，摄食后5天达到最高值后逐渐下降［24］,与ILF-IN基因的相对表达规律基本一致。

笔者课题组研究表明，HLF-HN蛋白和Hirudin蛋白均具有抑制凝血酶活性的功能(该研究尚未发表)，水蛭摄食血餐时将该类蛋白注入寄主促使血流保持通畅，确保顺利完成进食%摄食结束后，水蛭唾液腺中需要补充该类蛋白，以备下次摄食)水蛭通过摄食血餐激活该类基因高表达，当蛋白补足到摄食前水平后，基因表达量逐渐降低。

然而，日本医蛭的ILF-IV基因在高表达前先呈小幅下降表达，与Ikudk-IV基因下调表达的时间点不同，I.vereena的Ikudk基因在上调表达前则未出现下降趋势［24］，±述相关基因差异表达现象的内在机理有待进一步研究。

因此，为提高水蛭药材品质，收获水蛭药材时可在停食后待唾液腺补足HLF-HN蛋白等成分后再。

3结论
本研究克隆了日本医蛭ILF_IV基因的基因组序列，序列长度为662bp，含有相对保守的4个外显子和3个内含子结构。

荧光定量研究表，ILF-IV因在日医蛭唾腺异表达,经摄食处理后，ILF-IV基因表达呈现先下降后上升的趋势，在摄食后1天达到最高值，而后逐渐下降。

由本研究结果可知ILF-IV基因结
日本医蛭hPudki-like factor-H+基因克隆及表达模式研究
构相对保守,摄食血餐后该基因表达量显著升高，可为下一次摄食血餐储备抗凝蛋白，为适时采
水蛭提供理论依据。

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[责任编辑：吕娟]。