石蒜碱通过TLR4NF-κB途径抑制LPS诱导的原代小胶质细胞炎症反应

细胞与分子生物学石蒜碱通过TLR4/NF-κB途径抑制LPS诱导的原代小胶质
细胞炎症反应
抗晶晶1，曹翔1，2△
摘要：目的观察石蒜碱（LYC）对脂多糖（LPS）诱导的原代小胶质细胞炎症反应和表型变化的影响，并探讨其作
用机制。

方法将培养的原代小胶质细胞分为对照组、LYC组（0.1、0.5、1和5µmol/L LYC）、LPS组（0.1mg/L LPS）和LPS（0.1mg/L LPS）+LYC组（5µmol/L LYC）。

倒置显微镜观察细胞形态变化；流式细胞术检测原代小胶质细胞的纯度及LPS诱导原代小胶质细胞向两种表型转化的情况；CCK-8法检测细胞活性；实时荧光定量PCR（qPCR）检测白细
胞介素（IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）以及不同表型小胶质细胞表面标志物mRNA表达；Griess法检测一
氧化氮（NO）含量；免疫印迹法检测细胞TLR4、p-NF-κB p65蛋白表达情况。

结果原代小胶质细胞纯度达95%以上。

对照组及各浓度LYC组细胞活性差异无统计学意义。

后续实验以5µmol/L的LYC为药物浓度。

与LPS组相比，LPS+ LYC组的阿米巴样小胶质细胞数量明显减少，IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达水平以及NO含量降低，CD86mRNA表达水平和表型比例降低，CD206mRNA表达水平和表型比例升高，TLR4和p-NF-κB p65蛋白表达水平降低（P＜0.01）。

结论LYC通过TLR4/NF-κB信号通路抑制LPS诱导的原代小胶质细胞炎症反应，并促进其向“抑炎型”极化。

关键词：石蒜碱；小神经胶质细胞；脂多糖；Toll样受体4；NF-κB；炎症反应
中图分类号：R392.12文献标志码：A DOI：10.11985/20220323
Lycorine inhibited LPS-induced primary microglial inflammatory response via TLR4/NF-κB
signaling pathway
KANG Jingjing1,CAO Xiang1,2△
1Department of Biochemistry,School of Medicine,Huanghe College of Science and Technology,Zhengzhou450063,China;
2Department of Neurology,Nanjing Drum Tower Hospital,the Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School
△Corresponding Author E-mail:
Abstract:Objective To investigate the effect and potential mechanism of lycorine(LYC)on inflammatory response and phenotype of primary microglia induced by lipopolysaccharide(LPS).Methods The cultured primary microglia cells were divided into the control group,the LYC group(0.1,0.5,1and5µmol/L LYC),the LPS group(0.1mg/L LPS)and the LPS+LYC group(0.1mg/L LPS+5µmol/L LYC).The morphological changes of cells were observed under inverted microscope.Flow cytometry was used to detect the purity of primary microglia cells and the effect of LPS-induced cell proportion on the two phenotypes of primary microglia cells.Cell activity was detected by CCK-8method.The mRNA expressions of interleukin-1β(IL-1β),IL-6,tumor necrosis factor-α(TNF-α)and microglia surface markers of different phenotypes were detected by real-time fluorescence quantitative PCR(qPCR).The content of nitric oxide(NO)was determined by Griess method.The expression levels of TLR4and p-NF-κB p65protein were detected by Western blot assay.Results The purity of primary microglia was over95%.There was no significant difference in the cell activity between the control group and the LYC group.The concentration of LYC5µmol/L was used in subsequent pared with LPS group,the number of amoeba-like microglia was significantly reduced in the LPS+LYC group,expression levels of IL-1β, IL-6,TNF-αmRNA and NO content decreased,the expression level of CD86mRNA and phenotype ratio decreased,the expression level of CD206mRNA and phenotype ratio increased,and expression levels of TLR4and p-NF-κB P65protein were also decreased(P＜0.01).Conclusion Treatment with LYC inhibits LPS-induced primary microglial inflammatory response and promotes the anti-inflammatory polarization through TLR4/NF-κB signaling pathway.
Key words:Lycorine;microglia;lipopolysaccharides;Toll-like receptor4;NF-kappa-B;inflammatory response
基金项目：国家自然科学基金资助项目（82171310）；河南省民办普通高等学校学科专业建设资助项目（医学检验技术）
作者单位：1黄河科技学院医学院生化教研室（邮编450063）；2南京大学医学院附属鼓楼医院神经内科
作者简介：抗晶晶（1987），女，副教授，主要从事中药抗炎抗肿瘤机制研究。

E-mail：
△通信作者E-mail：
神经炎症是神经系统疾病发生发展的关键因素，小胶质细胞作为脑内固有的免疫效应细胞，参与神经炎症过程［1-2］。

静息态小胶质细胞能修复损伤、维持神经网络的正常功能；然而，微环境的变化会迅速活化小胶质细胞，过度活化的小胶质细胞主要转化为“促炎型”和“抑炎型”两种［3］。

“促炎型”小胶质细胞分泌炎性因子加重脑损伤；而“抑炎型”小胶质细胞通过释放神经营养因子修复神经元-胶质细胞-血管单元。

因此，抑制“促炎型”小胶质细胞异常激活及其介导的炎症反应被认为是治疗神经系统相关疾病的关键。

石蒜碱（Lycorine，LYC）是植物石蒜的主要活性成分，因其具有多种生物学效应而受到广泛关注［4-6］。

本课题组前期研究发现，LYC能够显著抑制脂多糖（LPS）诱导的外周巨噬细胞炎症反应［7］。

有研究证明LYC可降低大鼠脑卒中梗死体积并改善神经功能缺损，但具体机制不清［8］。

有关
LYC对神经炎症，尤其是小胶质细胞表型转换以及炎症反应影响的研究较少。

本研究旨在观察LYC对LPS诱导的原代小胶质细胞炎症反应和表型变化的作用，并对其机制进行探讨，为神经炎症性疾病的治疗提供新的思路和策略。

1材料与方法
1.1材料1~2日龄健康的SPF级C57BL/6新生小鼠60只，性别不限，体质量1.0~1.5g，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司［生产许可证号：SCXK（苏）2018-0008］。

LYC （纯度≥95%，CAS号2188-68-3）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

LPS购自美国Sigma公司；CCK-8、一氧化氮（NO）检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；兔抗小鼠Toll样受体4（TLR4）、核转录因子-κB p65亚基（NF-κB p65）、p-NF-κB p65、GAPDH抗体以及山羊抗兔二抗均购自美国Cell Signaling公司；CD11b（M1/70）、CD86（GL1）、CD206（MR6F3）及其同型对照流式抗体购自美国eBioscience公司；DMEM细胞培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、磷酸盐缓冲溶液（PBS）购自美国Gibco公司；RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒以及荧光定量试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；细胞裂解液和蛋白酶抑制剂购自江苏凯基技术股份有限公司。

倒置显微镜（型号：IX73）购自日本奥林巴斯公司；酶标仪（型号：SPARK）购自瑞士Tecan公司；荧光定量PCR仪（型号：StepOnePlus）购自美国ABI公司；凝胶成像仪（型号：1600）购自上海天能公司；流式细胞仪（型号：C6）购自美国BD公司。

1.2原代小胶质细胞培养取小鼠大脑皮层，加入胰蛋白酶消化10min后吸去胰蛋白酶终止消化。

将脑组织反复轻柔吹打成细胞悬液，经70µm滤器过滤后离心收集细胞，将细胞种于75cm2培养瓶并放于37℃、5%CO2细胞培养箱中常规培养。

培养2d后待细胞贴壁，全部换液，继续培养到第7天时再次全部换液。

每天观察细胞形态，第10天利用恒温摇
床，250r/min，15min，收集含有原代小胶质细胞的上清液进行后续实验。

将细胞分为对照组、LYC组、LPS组和LPS+
LYC组。

对照组细胞不做处理；LYC组细胞使用0.1、0.5、1和5µmol/L LYC处理24h；LPS组细胞使用0.1mg/L LPS处理24h；LPS+LYC组细胞使用5µmol/L LYC预处理1h后加入0.1mg/L LPS再处理24h。

利用倒置显微镜观察细胞形态并拍照记录。

1.3流式细胞术检测小胶质细胞纯度及LPS诱导原代小胶质细胞向两种表型转化情况收集对照组、LYC组、LPS组以及LPS+LYC组的原代小胶质细胞，加入表面流式抗体（CD11b、CD86和CD206）或相应的同型对照抗体，涡旋混匀后于室温下避光孵育15min，PBS洗涤细胞后300r/min离心15min，弃去上清液加入200µL PBS重悬细胞，在流式细胞仪上进行检测，结果采用FlowJo V10流式软件分析。

1.4细胞活性检测将对照组与LYC组细胞以5×104的密度均匀接种在96孔板中。

培养24h后弃旧培养基，再加入含有10%CCK-8溶液的新鲜培养基，于37℃孵育2h后置于酶标仪450nm波长下检测吸光度值。

1.5实时荧光定量PCR（qPCR）检测炎性因子和不同表型小胶质细胞表面标志物mRNA表达按RNA提取试剂盒说明书提取各组细胞的总RNA并进行逆转录，之后在荧光定量PCR仪器上进行PCR扩增，白细胞介素（IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等引物序列见表1，以GAPDH为内参。

20µL反应体系包括2×Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix10µL，上、下游引物（10µmol/L）各0.4µL，cDNA（50µg/L）
2.0µL，灭菌水7.2µL。

引物由南京擎科生物科技有限公司合成。

PCR扩增条件：95℃预变性5min；95℃10s，60℃30s，共40个循环。

每组设3个复孔，采用2-ΔΔCt法计算各基因mRNA相对表达量。

1.6NO检测收集各组的细胞上清液，利用经典的Griess 法测定NO含量。

1.7免疫印迹法检测TLR4/NF-κB信号通路蛋白表达将各组细胞用预冷PBS润洗3遍后，加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂后在冰上裂解30min，4℃12500r/min离心30min收基因名称
IL-1β
IL-6
TNF-α
CD86
CD206
GAPDH
引物序列（5′→3′）
上游：AAGCCTCGTGCTGTCGGACC
下游：TGAGGCCCAAGGCCACAGG
上游：GCTGGTGACAACCACGGCCT
下游：AGCCTCCGACTTGTGAAGTGGT
上游：CAAGGGACAAGGCTGCCCCG
下游：GCAGGGGCTCTTGACGGCAG
上游：GACCGTTGTGTGTGTTCTGG
下游：GATGAGCAGCATCACAAGGA
上游：TTCGGTGGACTGTGGACGAGCA
下游：ATAAGCCACCTGCCACTCCGGT
上游：GCCAAGGCTGTGGGCAAGGT
下游：TCTCCAGGCGGCACGTCAGA
产物大小（bp）
140
107
109
148
108
112 Tab.1The sequences of the primers for qPCR
表1qPCR引物序列
集上清蛋白。

BCA 法测定并计算蛋白浓度后取等量蛋白上样，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯胺凝胶电泳（SDS-PAGE ），将分离的蛋白采用湿转法转移到PVDF 膜上，之后置于5%的脱脂奶粉中封闭1h 。

一抗TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65（均为1∶1000稀释）、GAPDH （1∶5000）于4℃冰箱孵育过夜，次日回收一抗，PVDF 膜再与山羊抗兔IgG 二抗（1∶
5000）室温孵育1h ，化学发光法于凝胶成像仪器中显影，利用Image J 软件分析结果。

1.8
统计学方法
采用SPSS 19.0软件进行数据分析。

数据
采用x ±s 表示。

2组间比较采用独立样本t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t 检验。

P ＜0.05为差异有统计学意义。

2结果
2.1LYC 对原代小胶质细胞活性的影响流式细胞术结果示CD11b 阳性的原代小胶质细胞占总细胞的95%以上，见图1，满足实验要求。

对照组，0.1、0.5、1和5µmol/L LYC 组细胞活性分别为1.000±0.037、1.023±0.024、1.064±0.121、0.960±0.022和1.026±0.038，差异无统计学意义（n =4，F =1.598，P ＞0.05）。

为研究LYC 的最大有效剂量，后续研究均以5µmol/L 的LYC 为药物浓度。

LYC 组小胶质细胞的形态并未改变，但是LPS 组小胶质细胞突起缩短变厚，胞体增大，呈现阿米巴样，LPS+LYC 组阿米巴样小胶质细胞数量明显减少，见图2。

2.2LYC 对原代小胶质细胞炎性因子mRNA 表达
水平及NO 含量的影响与对照组相比，LPS 组IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA 表达水平以及NO 含量的表达升高（P ＜0.01）；与LPS 组比较，LPS+LYC 组以上炎性细胞因子表达水平和NO 含量降低（P ＜0.01），见表2。

2.3LYC 对小胶质细胞CD86、CD206mRNA 和表型比例的影响与对照组相比，LPS 组CD86和CD206mRNA 表达水平和表型比例升高（P ＜0.01）；与LPS 组比较，LPS+LYC 组CD86mRNA 表达水平和表型
比例降低，CD206mRNA 表达水平和表型比例升高
（P ＜0.01）。

见表3，图3。

对照组LYC 组
LPS 组
LPS+LYC 组
Fig.2Effects of LYC on the morphology of primary
microglia cells (×200)
图2
LYC 对原代小胶质细胞形态的影响（×200）
组别对照组LYC 组LPS 组LPS+LYC 组F IL-1βmRNA 1.026±0.1371.135±0.507
1357.000±186.300a 631.900±83.950ab
159.500＊＊
IL-6mRNA 1.047±0.1181.032±0.156
3644.000±391.400a
1549.000±267.200ab
212.000＊＊
组别对照组LYC 组LPS 组LPS+LYC 组
F TNF-αmRNA 1.036±0.1281.136±0.508
397.700±62.410a
248.800±45.230ab
103.100＊＊
NO 含量
1.185±0.366
2.238±0.949
28.770±2.472a
18.830±4.847ab
93.640＊＊Tab.2Comparison of IL-1β,IL-6and TNF-αmRNA expression level and NO content between the four groups
表2
各组IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA 水平及
NO 含量比较（n =4，
µmol/L ，x ±s ）＊＊
P ＜0.01；a 与对照组比较，b
与LPS 组比较，P ＜0.01；表3、4同。

组别对照组LYC 组LPS 组LPS+LYC 组F
CD86mRNA 0.921±0.0620.741±0.2076.003±1.094a 3.427±0.542ab 63.910＊＊
CD206mRNA
1.190±0.4190.972±0.2783.682±0.584a 6.200±0.695ab 89.730＊＊
CD86（%）
9.150±0.3879.020±0.48636.150±2.525a 22.400±2.754ab 186.600＊＊
CD206（%）
8.463±0.6978.850±0.26516.680±1.396a
25.150±1.234ab
246.500＊＊
Tab.3Comparison of CD86and CD206mRNA expression
levels and phenotypic ratio between the four groups 表3各组CD86和CD206mRNA 表达水平和
表型比例比较
（n =4，x ±s ）CD11b ，FSC-H subset
97.8%
50k 100k 150k 200k 250k 0
103
104
105
Fig.1Purity verification of primary microglia cells
图1
原代小胶质细胞纯度验证
F S C -H
CD11b
LPS+LYC 组
1021001041061081010
LPS 组
1021001041061081010
LYC 组
1021001041061081010对照组
1021001041061081010
LPS+LYC 组
1021001041061081010
LYC 组
1021001041061081010
LPS 组
1021001041061081010
对照组
1021001041061081010
A ：CD86阳性的小胶质细胞比例；
B ：CD206阳性的小胶质细胞比例。

Fig.3
The flow cytometry results of LYC on different phenotypic primary microglia cells induced by LPS
图3
LYC 对LPS 诱导的原代小胶质细胞不同表型的流式图
2.4LYC 对LPS 诱导的原代小胶质细胞TLR4/NF-κB 信号通路的影响与对照组相比，LPS 组TLR4和p-NF-κB p65蛋白表达水平升高（P ＜0.01）；与LPS 组比较，LPS+LYC 组
TLR4
和p-NF-κB
p65蛋白表达水平降低（P ＜0.01），见图4，表4。

3讨论
小胶质细胞介导的神经炎症已被证实是神经退行性疾病，如阿尔茨海默病、帕金森及脑卒中预后的重要因素。

研究表明，活化的小胶质细胞释放的炎症介
质能促进β-淀粉样蛋白（Aβ）产生和积累［9］。

帕金森死亡患者脑组织中可以检测到小胶质细胞的异常激
活以及相关的炎性细胞因子释放［10］。

过度激活的小胶质细胞在脑卒中早期和晚期的继发性损伤中起到
关键作用，加重脑损伤［11-12］。

因此，干预小胶质细胞介导的炎症反应是治疗以上神经系统疾病的有效方法。

石蒜是一味中草药，主要生长在我国长江以南地区。

LYC 是石蒜提取物中最主要的活性物质，本质上是一种吡咯并菲啶的环形生物碱。

研究发现，LYC 能抑制肿瘤细胞转移和细胞周期进程，促进肿
瘤细胞凋亡［4，13］。

近年有研究表明，LYC 能剂量依赖性地抑制感染细胞中新型冠状病毒的复制［14］。

炎症方面，LYC 被证实能够减少LPS 诱导的骨丢失［15］。

同时，笔者之前的研究发现LYC 具有改善外周巨噬细胞炎症反应的能力［7］。

然而关于LYC 对小胶质细胞介导的炎症反应的作用甚少。

本研究的结果显示，LPS 刺激可促使小胶质细胞向阿米巴样转变，增加了炎性细胞因子的表达以及“促炎型”小胶质细胞的比例，而LYC 可以改善原代小胶质细胞的形态，抑制炎性细胞因子表达，并提高“抑炎型”小胶质细胞
组别对照组LYC 组LPS 组LPS+LYC 组F
TLR4
0.992±0.1531.391±0.180
2.547±0.016a 1.665±0.207ab
52.930＊＊p-NF-κB p651.000±0.0641.139±0.063
2.214±0.242a 1.246±0.384b
17.070＊＊
Tab.4Comparison of TLR4/NF-κB signaling pathway protein expression levels between the four groups
表4
各组TLR4/NF-κB 信号通路蛋白表达水平比较
（n =3，x ±s ）
对照组
LYC 组
LPS 组LPS+LYC 组
TLR4
p-NF-κB p65NF-κB p65GAPDH Fig.4Effects of LYC on TLR4/NF-κB signaling pathway in LPS-induced primary microglia cells
图4
LYC 对LPS 诱导的原代小胶质细TLR4/NF-κB
信号通路的影响
的比例。

这些结果提示LYC具有拮抗LPS诱导的小胶质细胞炎症反应的能力，且与其促进小胶质细胞由“促炎型”向“抑炎型”的转化有关。

目前，大量研究表明多个信号通路在小胶质细胞表型转化中发挥作用。

Li等［16］发现环状RNA-
Prkcsh通过JNK/p38MAPK通路促进小胶质细胞向“脊髓损伤”型极化。

有关系统性红斑狼疮的研究发现，丙酮酸激酶通过β-catenin信号通路促进小胶质细胞向“吞噬型”转化，破坏认知功能［17］。

TLR4/NF-κB是目前被研究较多且明确与小胶质细胞表型转化有关的通路。

TLR4作为LPS的受体，其在脑内大量表达于小胶质细胞［18］。

TLR4被激活后在细胞质内形成复合体，继而通过磷酸化NF-κB将信号传递到细胞核内。

磷酸化的NF-κB启动细胞核中下游相关基因的转录，生成相应的mRNA，合成炎性因子和控制小胶质细胞表型转化的蛋白，引起一系列炎症反应［19］。

本研究结果显示，LPS刺激增加了TLR4的表达和NF-κB p65的磷酸化水平，而LYC可以逆转这一现象，提示LYC可能通过抑制TLR4/NF-κB 信号通路，抑制小胶质细胞向“促炎型”转化，进而降低促炎细胞因子的表达，减轻炎症反应。

综上所述，LYC能减轻LPS所致的小胶质细胞炎症反应，可能是通过抑制TLR4/NF-κB信号通路来实现的。

本研究为开发LYC作为一种新的神经系统疾病保护药物提供了实验依据。

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（2022-02-28收稿2022-03-30修回）
（本文编辑李志芸）。