姜黄标准汤剂HPLC_指纹图谱结合化学模式识别研究

引用格式：陈洁文，杨　华，何述金，等. 姜黄标准汤剂HPLC指纹图谱结合化学模式识别研究[J]. 湖南农业科学，2023（0）：81-86.　DOI:
DOI:10.16498/ki.hnnykx.2023.003.017
姜黄（Curcuma longa L.）是姜科姜黄属多年生草本植物，具有破血行气，通经止痛功效[1]，临床上用于治疗经行不畅、颈椎病和肩周炎的肩臂酸痛、慢性胆囊炎和胆石症等疾病。

姜黄主要含挥发油类和姜黄素类成分[2]，其中姜黄素具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗糖尿病等药理作用[3]。

标准汤剂作为中药饮片与中药配方颗粒的连接桥梁，用于衡量中药配方颗粒与其对应的单味中药饮片临床汤剂药效物质是否基本一致[4]。

中药汤剂和颗粒剂都不能通过其形态学特征对其质量进行控制，因而利用HPLC 指纹图谱技术对中药汤剂进行质量控制已成趋势[5]。

研究以姜黄标准汤剂为材料，拟通过HPLC指纹图谱的构建和化学模式识别分析，为姜黄汤剂与配方颗粒等相关产品的检测提供参考和帮助。

1　材料与方法
1.1　试验材料
1.1.1　供试姜黄样品　姜黄原药材分别来自四川、
 姜黄标准汤剂HPLC指纹图谱结合化学模式识别研究 陈洁文1，杨　华1，何述金2，周代俊2，黄黎明2，赵悦辛1
（1.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙 410128；
2.湖南新汇制药股份有限公司，湖南长沙 410299）
摘　要：为了建立姜黄标准汤剂的HPLC指纹图谱，以来自四川、云南和广西的15个批次姜黄饮片为原料制备姜黄标准汤剂冻干粉，通过优化样品提取工艺和色谱条件，对姜黄标准汤剂的主要成分进行HPLC分析和化学模式识别分析。

结果表明：15批姜黄标准汤剂的HPLC指纹图谱共标定了13个共有峰，确认了11、12和13号峰分别为双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素；通过主成分分析筛选出了2个差异性成分（3号峰和4号峰），但目前还不能确定其所代表的物质；15批姜黄标准汤剂的相似度评价结果均大于0.9，整体可以聚为2大类，其中S5、S11和S14聚为一类，其余批次聚为一类。

该HPLC指纹图谱方法呈现良好的精密度、重复性和稳定性，可为姜黄标准汤剂及中药配方颗粒产品质量控制提供参考和帮助。

关键词：姜黄；标准汤剂；HPLC；指纹图谱；化学模式识别分析
中图分类号：R282.5 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2023）00-0081-06 Study on HPLC F ingerprint Combined with Chemical Pattern Recognition of Turmeric
Standard Decoction
CHEN Jie-wen1, YANG Hua1, HE Shu-jin2 , ZHOU Dai-jun2, HUANG Li-ming2, ZHAO Yue-xin1
（1. College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC;
2. Hunan Xinhui Pharmaceutical Co.,Ltd., Changsha 410299, PRC）
Abstract： T o establish the HPLC fingerprint of turmeric (Curcuma longa L.) standard decoction for its quality control, turmeric decoction pieces processed with 15 batches of Curcuma longa L. raw meterial from Sichuan, Yunnan and Guangxi were prepared as freeze-dried powder in laboratory for later extraction. Subsequently, the extraction process and chromatographic conditions were optimized. The obtained standard turmeric decoction samples were performed the principle component analysis by HPLC and chemical pattern recognition. The results showed that a total of common 13 peaks in the HPLC fingerprints of the 15 batches of turmeric standard decoction samples were marked; peaks 11, 12 and 13 were identified as bisdemethoxycurcumin, demethoxycurcumin and curcumin; two different components (peak 3 and peak 4) were screened out by the principal component analysis, but the substances they represented were still uncertain. The similarities of the 15 batches of turmeric standard decoction were evaluated greater than 0.9, and they could be divided into two categories, among which S5, S11 and S14 clustered into one category, and the remaining batches clustered into the other category. This HPLC fingerprinting method presents good precision, reproducibility and stability, which can provide reference and help for the quality control of turmeric standard decoction and traditional Chinese medicine formula granule products.
Key words：turmeric (Curcuma longa L.); standard decoction; HPLC; fingerprint; chemical pattern recognition analysis
收稿日期：2022-11-23
基金项目：湖南省农业产业技术体系中药材体系岗位专家（湘农发
〔2019〕105号）
作者简介：陈洁文（1998—），女，广东封开县人，硕士研究生，
主要从事植物资源利用研究
通信作者：杨　华
　湖南农业科学（HUNAN AGRICULTURAL SCIENCES）2023年3月
云南和广西3地，产地信息见表1。

参考《中华人民共和国药典》2020年版姜黄项下炮制方法将原材料制成饮片，产品批号为T210801~T210815，生产日期均为2021年8月7日，由长沙新林制药有限公司于2021年8月8日收录入库。

1.1.2　主要试剂　双去甲氧基姜黄素（批号112004-201501，纯度95.0%），去甲氧基姜黄素（批号112003-201501，纯度98.5%），姜黄素对照品（批号110823-201706，纯度98.7%），姜黄对照药材（批号：121188-201605），均采购于中国食品药品检定研究所。

乙腈、甲醇为色谱纯，磷酸为分析纯。

试验用水为怡宝矿泉水。

表1　供试的15批姜黄的产地信息
编号产品批号产地
S1T210801云南省泸水市
S2T210802云南省泸水市
S3T210803云南省泸水市
S4T210804云南省泸水市
S5T210805云南省泸水市
S6T210806云南省泸水市
S7T210807云南省泸水市
S8T210808广西省玉州区
S9T210809广西省玉州区
S10T210810广西省玉州区
S11T210811广西省玉州区
S12T210812广西省玉州区
S13T210101四川省什邡市
S14T210501四川省什邡市
S15T210601四川省什邡市1.1.3　主要仪器设备　Thermo Scientific Vanquish Core 高效液相色谱仪、循环水式多用真空泵（天津市心雨仪器有限公司），电子万用炉（北京市永光明医疗仪器有限公司），KQ5200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声波仪器有限公司），电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司），ME204E102型电子天平（梅特勒–托利多仪器有限公司）。

1.2　试验方法
1.2.1　姜黄标准汤剂冻干粉的制备　参照《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》（征求意见稿）制备15批姜黄标准汤剂，具体步骤如下：称取姜黄饮片100 g，加水煎煮2次，第1次加入10倍水量，浸泡30 min，武火煮沸后改文火煎煮30 min，过滤；第2次加入8倍水量，武火煮沸后改文火煎煮20 min，过滤，合并2次滤液，减压真空浓缩至约200 mL，真空冷冻干燥，即得姜黄标准汤剂冻干粉[6]。

1.2.2　色谱条件优化　采用岛津Shim-pack GIST C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm），考察了不同流动相（0.1%甲酸–乙腈、0.1%磷酸–乙腈、水–乙腈、
0.1%磷酸–甲醇等为流动相系统，0.1%磷酸–乙腈）、不同洗脱梯度、不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）、不同检测波长（254、290、310 nm）、不同柱温（25、30、35℃）和不同进样量（5、10、20 µL）对图谱分离效果的影响，进而确定最佳的色谱条件。

1.2.3　供试品溶液制备方法优化　考察了样品提取方法（超声提取、回流提取）、不同提取溶剂（甲醇、乙醇、70%甲醇、70%乙醇）、不同提取时间（20、30、40 min）、不同样品量（0.2、0.4、0.6 g）和不同溶剂量（10、20、50 mL）对提取效果的影响，根据最终的色谱峰形确定最佳的供试品溶液制备方法。

1.2.4　对照品溶液制备　精密称取双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素对照品适量，加入甲醇溶解，分别制成58.35、37.75、36.99 µg/mL的对照品溶液。

1.2.5　对照药材溶液制备　取姜黄对照药材0.5 g，加水25 mL煎煮30 min，蒸干水分，精密加入70%乙醇溶液20 mL，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用70%乙醇溶液补充损失重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得对照药材溶液。

1.2.6　方法学验证试验　（1）专属性试验：取供试品溶液、姜黄对照药材溶液及双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素对照品溶液与空白对照，按最佳色谱条件分别进样分析，对比图谱结果以验证该方法的专属性。

（2）精密度试验：取供试品溶液1份，按最佳色谱条件连续进样6次，对比图谱结果以验证仪器的精密度。

（3）重复性试验：取同一批次的姜黄标准汤剂，按最佳制备方法平行制备6份供试品溶液按最佳色谱条件进样，对比图谱结果以验证该方法的重复性。

（4）稳定性试验：取姜黄标准汤剂供试品1份，分别在配制后0、2、4、8、12、24 h按最佳色谱条件进样，对比图谱结果以验证所提取样品的稳定性。

1.2.7　指纹图谱的建立及相似度评价　按最佳制备方法制备15批姜黄标准汤剂供试品溶液，按最佳色谱条件进行分析，得到15批姜黄标准汤剂HPLC图谱，将图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012版）生成共有峰对照图谱（R），并计算15批姜黄标准汤剂与对照指纹图谱的相似度结果。

1.2.8　数据分析　（1）聚类分析：将15批姜黄标准汤剂的13个共有峰的原始峰面积导入Origin 2019b 软件，通过平均联接（组间）方法，以平方欧式距离为测量度进行聚类分析。

（2）主成分分析（PCA）：通过SPSS 25.0软件对15批姜黄标准汤剂进行主成分分析，计算主成分特征值与方差贡献值。

（3）正
陈洁文等：姜黄标准汤剂HPLC 指纹图谱结合化学模式识别研究
交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA ）：将共有峰的峰面积导入SIMCA 13.0软件生成OPLS-DA 得分图。

2　结果与分析2.1　最佳色谱条件
试验结果显示，以0.1%磷酸（B ）–乙腈（A ）为流动相系统时，图谱的分离度最佳，峰形良好。

通过洗脱梯度的不断调整，最终确定的洗脱梯度为：0~25 min ，90%~55% B ；25~30 min ，55% B ；30~50 min ，55%~35% B ；50~55 min ，35%~55% B ；55~60 min ，55%~90% B 。

当流速大于0.8 mL/min ，组分峰过于紧凑，分离度不佳。

当检测波长为310 nm 时，图谱信息最为丰富。

当柱温为30℃时，出现了2峰融合的情况；当柱温为35℃时，出现了组分峰分叉的情况；因而最终将柱温确定为25℃，该温度下峰形良好。

当进样量为5 µL 时，因样品较少，易出现误差；当进样量为20 µL 时，出现了峰形分叉的现象，故还是选取常规进样量10 µL 进行分析检测。

综上所述，最终确定的色谱条件如下：采用岛津Shim-pack GIST C18色谱柱（250 mm ×4.6 mm ，5 µm ），以乙腈为流动相A 、0.1%磷酸溶液为流动相B 进行梯度洗脱（0~25 min ，90%~55% B ；25~30 min ，55% B ；30~50 min ，55%~35% B ；50~55 min ，35%~55% B ；55~60 min ，55%~90% B ），流速0.8 mL/min ，检测波长310 nm ，柱温25℃，进样量10 µL 。

2.2　最佳供试品制备方法
试验结果显示，超声提取方法的安全系数较高，以70%乙醇为提取溶剂效果最好且毒性最低，最佳
提取时间为30 min ；以不同的溶剂量（10、20、50 mL ）和样品量（0.2、0.4、0.6 g ）分别进行提取，各组合的峰形基本一致，成分含量增减有规律。

最终确定供试品溶液制备方法如下：精密称取0.2 g 姜黄标准汤剂冻干粉置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇溶液20 mL ，密塞，称定重量，超声处理30 min ，放冷，再称定重量，用70%乙醇溶液补充损失重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3　方法学验证结果
2.3.1　专属性试验　如图1所示，姜黄标准汤剂与姜黄对照药材的出峰时间基本一致，通过外标法得到双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素在标准汤剂中的出峰时间。

2.3.2　精密度试验　以姜黄素（L4）为参照峰，计算各共有峰相对保留时间的RSD 均小于0.08%，相对峰面积的RSD 均小于3.29%，表明该仪器有良好的精密度。

2.3.3　重复性试验　以姜黄素（L4）为参照峰，计算各共有峰相对保留时间的RSD 均小于0.07%，相对峰面积的RSD 均小于3.08%，表明该方法有良好的重复性。

2.3.4　稳定性试验　以姜黄素（L4）为参照峰，计算各共有峰相对保留时间的RSD 均小于0.08%，相对峰面积的RSD 均小于5.22%，表明样品溶液在24 h 内有良好的稳定性。

2.4　指纹图谱的建立及相似度评价
供试的15批姜黄标准汤剂的HPLC 图谱如图2
所示，各批次样品的各种物质出峰时间基本相同，
图1　专属性试验的HPLC 图谱
（L1：空白对照；L2：双去甲氧基姜黄素；L3：去甲氧基姜黄素；L4：姜黄素；L5：姜黄对照药材；L6：姜黄标准汤剂）
　湖南农业科学（HUNAN AGRICULTURAL SCIENCES ）2023年3月
图2　供试15批姜黄标准汤剂的HPLC 叠加图谱
图3　供试15批姜黄标准汤剂的共有峰对照图谱（R ）
呈现出良好的一致性。

根据共有峰对照图谱（图3），一共标定了13个共有峰，指认了3个成分，11号峰为双去甲氧基姜黄素、12号峰为去甲氧基姜黄素、13号峰为姜黄素。

以姜黄素（13号峰）为参照峰，得到其余各峰的相对保留时间如下：峰1为0.301，峰2为0.377，峰3为0.403，峰4为0.420，峰5为0.494，峰6为0.511，峰7为0.596，峰8为0.605，峰9为0.634，峰10为0.931，峰11为0.958，峰12为0.979，峰13为1.000。

计算得到15批姜黄标准汤剂与对照药剂的指纹图谱相似度均大于0.9，表现出标准汤剂的均一性，具体见表2。

2.5　供试15批姜黄标准汤剂的聚类分析
如图4A 所示，在分类距离为15时，供试15批姜黄标准汤剂聚为2大类，其中S1~S4、S6~S10、S12、S13、S15归为一类，S5、S11、S14归为另一类。

2.6　姜黄标准汤剂的主成分分析（PCA ）
如表3所示，3个主成分累计方差贡献值达0.905，可以代表样品大部分信息。

由表4可知，2、3、5、9、11号峰对主成分1的贡献值最大，去甲氧基姜黄素（12号峰）、姜黄素（13号峰）对主成分2贡献值最大，1和8号峰对主成分3的贡献值最大。

采用SIMCA 13.0软件绘制主成分分析得分图，如图
陈洁文等：姜黄标准汤剂HPLC指纹图谱结合化学模式识别研究
表2　供试15批姜黄标准汤剂的相似度评价结果
样品编号S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12S13S14S15R S11
S20.9731
S30.9910.9941
S40.9830.9460.9671
S50.9740.9870.9830.9701
S60.9910.9810.9880.9870.9931
S70.9750.9970.9910.9590.9950.9891
S80.9930.9890.9960.9790.9900.9970.9931
S90.9830.9800.9870.9880.9880.9940.9870.9931
S100.9840.9790.9840.9830.9960.9980.9890.9940.9921
S110.9700.9920.9850.9620.9980.9890.9980.9890.9870.9901
S120.9730.9660.9710.9790.9930.9920.9800.9830.9820.9970.9851
S130.9820.9800.9840.9810.9970.9970.9900.9930.98910.9910.9981
S140.9530.9930.9780.9360.9910.9750.9960.9780.9720.9770.9960.9700.9791
S150.9980.9680.9890.9820.9680.9880.9700.9910.9810.9810.9640.9700.9790.9451 R0.9870.9900.9920.9800.9970.9980.9960.9970.9940.9970.9950.9910.9970.9860.9831
表3　姜黄标准汤剂的PCA特征值与方差贡献值
主成分特征值方差贡献率累计方差贡献率
17.6630.5890.589
2 2.6240.2020.791
3 1.4800.1140.905
表4　姜黄标准汤剂的主成分矩阵结果色谱峰编号成分1成分2成分3
90.9400.195-0.241
110.9250.295-0.210
30.902-0.4220.010
50.899-0.047-0.324
20.892-0.398-0.078
70.8560.082-0.337
60.851-0.3130.130
40.796-0.5050.270
80.7730.3020.522
120.6630.642-0.209
130.1990.7720.495
10.259-0.6490.560
100.5220.5290.434
4B所示，结果与聚类分析一致。

2.7　姜黄标准汤剂的正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）
由图4C得到R2X（cum）=0.876，R2Y（cum）= 0.762，Q2（cum）=0.653。

如图4D显示，3和4号峰这2个成分的VIP值大于1，说明这2个组分为主要标志性成分。

3　讨　论
15批姜黄中，S1~S7来自云南省泸水市，S8~S12来自广西省玉州区，S13~S15来自四川省什邡市，试验从这15批姜黄标准汤剂HPLC图谱中共标定了13个共有峰，并确认了其中的3个成分为双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素。

邓哲等[7]从13批姜黄饮片标准汤剂HPLC图谱中确定了16个共有峰，也确认了其中的双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素这3个成分。

由15批姜黄标准汤剂HPLC图谱的出峰情况以及相似度评价结果可知，各批次姜黄标准汤剂的图谱出峰情况一致性很高，S4样品的图谱与S14样品的图谱相似度最低，但也达到了0.936，总体相似度在0.936~1.000之间。

相似度评价结果越接近1，表示批次之间一致性评价效果越好。

但是化学模式识别分析结果显示，15批姜黄标准汤剂聚为2大类，其中S5、S11和S14聚为一类，其余批次聚为一类，聚类结果与产地信息有较大差别，这可能与姜黄的其他特性有关。

例如，黄玉洁[8]在研究川渝麦冬资源时发现，不同产地麦冬间的聚类与其地理来源无关，但与其形态特征相关联。

HPLC图谱中，3号峰和4号峰为姜黄标准汤剂间的差异性成分。

查阅大量文献后发现，姜黄的研究大多数集中在姜黄素类化合物，其药理活性被大量挖掘，由于对于其他成分的研究较少，目前还不能确定3号峰和4号峰所代表的物质。

同时，由于姜黄素难溶于水的特性，制备标准汤剂大大降低了姜黄有效成分的含量。

因此，使用姜黄汤剂制备的姜黄配方颗粒姜黄素含量也相对较少，其效果也难免让人产生质疑。

后续考虑使用液质联用对3号峰和4号峰进行成分分析，确认其分子量，查询这2种成分是否为药用成分，如若结果可观，或许能够对姜黄标准汤剂的开发应用提供帮助。

如今中药材市场仍然存在掺假、以次充好、种质资源混乱的现象，为了更好地维护中药材市场秩序，建立规范的中药材品质检测方法乃大势所趋。

通过查阅国内外文献发现，目前针对姜黄化学成分、药理作用[9-10]的文献报道居多，质量评价也主要集
　湖南农业科学（HUNAN AGRICULTURAL SCIENCES ）2023年3月峰 号
V I P 值
D
1.0007 t[1]
*1.23917 t [2]
*C
编 号
分类距离
A
t[1]
t [2]
B
图4　供试15批姜黄标准汤剂的HPLC 图谱分析
（A ：聚类分析图；B ：PCA 得分图；C ：OPLS-DA 得分图；D ：VIP 值图）
中在姜黄原药材和饮片方面，以标准汤剂为研究对象的相对较少。

该研究建立的姜黄标准汤剂HPLC 指纹图谱方法呈现良好的精密度、重复性与稳定性，可为姜黄标准汤剂与配方颗粒等相关产品检测提供参考和帮助。

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（责任编辑：成　平）。