酵母可同化氮含量对低产硫化氢酿酒酵母发酵特性的影响

葡萄汁中含氮化合物的含量和比例，因葡萄品种、栽培方式、采收时间等因素的不同而存在差异[1-2]。

氮源的存在形式包括铵离子、氨基酸、多肽和蛋白质，但是只有铵离子和一些氨基酸可以被酵母吸收利用，此类氮源称为酵母可同化氮（yeast assimilable nitrogen ，YAN ）[3-4]。

在无其他限制因素情况下，YAN 决定酵母细胞生长速度和酒精发酵速率[1，5]，影响发酵过程中微生物的代谢，导致葡萄酒中化学成分的差异[6-7]。

在葡萄酒酿造过程中，酿酒酵母除了进行酒精发酵外，还会利用其自身的硫酸盐还原途径，代谢生成H 2S 。

H 2S 具有臭鸡蛋气味，且阈值很低，会严重损坏葡萄酒感官质量[8]。

酿酒酵母的基因背景差异是造成H 2S 释放量不同的主要原因[9]。

同时，还有很多因素影响酵母产H 2S ，如碳源、氮源、硫源、温度等不同的培养条件[10]。

因此，酿酒酵母代谢产H 2S 受菌株遗传背景和环境的双重影响。

研究发现[11-12]，发酵过程中H 2S 的总产量与发酵液中的氮含量成反比。

然而，SANTIAGO M 等[13-14]研究发现，添加YAN 不仅不会减少H 2S 的产生，甚至在某些情况下会加剧H 2S 的释放，并具有菌株依赖性。

目前，最常见的处理H 2S 的方法是向葡萄醪中添加磷酸氢二铵或磷酸铵，不仅可以提高发酵速率，也能有效降低H 2S 的产量[15]。

但是，若添加不当，也会产生适得其反的效果[16]。

因此，了解每个菌株的具体氮需求，可有酵母可同化氮含量对低产硫化氢酿酒酵母发酵特性的影响刘芳利1,冯文倩1,何沛莹1,宋育阳1,2,秦义1,2,刘延琳1,2*(1.西北农林科技大学葡萄酒学院,陕西杨凌712100;2.陕西省葡萄与葡萄酒工程技术研究中心,陕西杨凌712100)摘要：该研究以3株本土低产硫化氢酿酒酵母（）41y5、182y12和174y1为研究对象，研究酵母可同化氮（YAN ）的质量浓度对其发酵特性的影响，并对不同菌株各指标间的相关性进行分析。

结果表明，随着初始YAN 质量浓度的升高，酵母的生物量越大，发酵周期越短；发酵后模拟酒的挥发酸含量和pH 值升高；初始YAN 质量浓度对菌株产H 2S 的影响不同。

初始YAN 质量浓度与CO 2平均释放速率、挥发酸含量、pH 值呈极显著正相关（＜0.01），与最大生物量呈显著正相关（＜0.05），与H 2S 释放量无显著相关性（＞0.05），且在发酵过程中H 2S 的释放量与发酵后模拟酒的pH 值存在显著的正相关（＜0.05）。

与酿酒酵母41y5和182y12相比，酿酒酵母174y1在4个初始YAN 质量浓度下，生物量均最高，发酵周期均最短，发酵性能优良。

关键词：酵母可同化氮；硫化氢；酿酒酵母；发酵特性中图分类号：TS261文章编号：0254-5071（2019）07-0020-05doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2019.07.005引文格式：刘芳利，冯文倩，何沛莹，等.酵母可同化氮含量对低产硫化氢酿酒酵母发酵特性的影响[J].中国酿造，2019，38（7）：20-24.LIU Fangli 1,FENG Wenqian 1,HE Peiying 1,SONG Yuyang 1,2,QIN Yi 1,2,LIU Yanlin 1,2*three native low-yield H 2S 41y5,182y12and 174y1as research objects,the effects of yeast assimilable ni-trogen (YAN)concentration on the fermentation characteristics of these strains were studied,and the correlation between the indicators of different strains was analyzed.The results showed that with the increase of initial YAN concentration,the biomass of yeast increased and the fermentation cycle shortened;the volatile acid content and pH of simulated wine increased after fermentation;the initial YAN concentration had different effects on H 2S production of three strains.The initial YAN concentration had highly significant positive correlation with the average CO 2release rate,volatile acid content and pH (＜0.01),and had significant positive correlation with the maximum biomass (＜0.05),and had no significant correlation with H 2S release amount (＞0.05).There was a significant positive correlation between the H 2S release amount and the pH of the simulated wine after fermen-tation (＜0.05).Compared with41y5and 182y12,174y1had the highest biomass,shortest fermentation cycle and excel-lent fermentation property at the four initial YANconcentrations.assimilable nitrogen;hydrogen sulfide;;fermentation property收稿日期：2019-01-15修回日期：2019-05-11基金项目：国家自然基金项目（31571812，31501463）；国家现代农业（葡萄）产业技术体系建设专项（CARS-29-jg-03）作者简介：刘芳利（1994-），女，硕士研究生，研究方向为酿酒微生物。

*通讯作者：刘延琳（1966-），女，教授，博士，研究方向为酿酒微生物。

效降低发酵迟滞和H 2S 大量生成的风险[17]。

目前，葡萄酒酿造中使用的酵母多以中低产H 2S 酿酒酵母（）为主，本研究以3株本土低产硫化氢的野生型酿酒酵母41y5、182y12和174y1为研究对象，利用Triple M 培养基，即模拟葡萄汁，探索不同初始YAN 质量浓度对酿酒酵母发酵特性的影响，并对各指标间的相关性进行分析。

旨在筛选不同初始YAN 质量浓度下低产或不产H 2S 的酿酒酵母，有助于本土酿酒酵母的应用，对生产有现实指导意义。

1材料与方法1.1材料与试剂1.1.1菌株酿酒酵母（）41y5、182y12、174y1、112y4：由西北农林科技大学葡萄酒学院从陕西省咸阳市泾阳县自然发酵葡萄醪中筛选的本土野生型低产H 2S 酿酒酵母。

1.1.2化学试剂葡萄糖、果糖、无氨基酵母氮源（yeast-nitrogen-base without amino acids ，YNB ）（均为生化试剂）、麦角固醇、-脯氨酸、-精氨酸（纯度均＞99%）：北京索莱宝科技有限公司；-（+）酒石酸、-（-）苹果酸、无水柠檬酸（纯度均＞99%）：阿拉丁试剂（上海）有限公司；水解酪蛋白、半乳糖（纯度均＞99%）：美国Sigma 公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3培养基酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose ，YPD ）培养基：葡萄糖20g/L ，蛋白胨20g/L ，酵母粉10g/L ；固体培养基中添加琼脂20g/L ，115℃高压灭菌30min 。

Triple M 培养基（模拟葡萄汁）：参照MART ÍNEZ-MORENO R 等[18]的方法配制。

Triple M 培养基中的氮源质量浓度为300mg/L （包括120mg/L 无机铵盐与180mg/L 混合氨基酸），参照BELTRAN G 等[3]的方法将Triple M 培养基中的无机铵盐与混合氨基酸按同样比例进行调节，将初始可同化氮的质量浓度分别调整为100mg/L 、200mg/L 、300mg/L 和400mg/L ，分别简写为N100、N200、N300和N400。

Triple M 培养基的正常pH 值为3.25，因此，将N300的Triple M 培养基的初始pH 值用4mol/L 氢氧化钾分别调整为3.2、3.6和4.0。

1.2仪器与设备MJPS-250型恒温培养箱、DHG-9071A 鼓风干燥箱、DK-S22电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；ZWY2102全温摇床：上海智诚分析仪器制造有限公司；UV1800紫外可见分光光度计：日本岛津公司；PB-10酸度计：北京赛多利斯仪器系统有限公司；BK1301生物显微镜：重庆光电仪器有限公司；SBA-40D 型生物传感分析仪：山东省科学院生物研究所；YBL10-71103血球计数板：上海求精生化试剂仪器有限公司；H 2S 检测管：上海豫东电子科技有限公司。

1.3方法1.3.1酿酒酵母发酵速率的测定采用含4种质量浓度可同化氮源（N100、N200、N300和N400）的TripleM 培养基发酵。

酵母的接种量为5×106CFU/mL ，装液量为300mL/500mL ，发酵温度为20℃，静置发酵，每个实验组均重复3次。

发酵期间每24h 称质量，监测CO 2质量损失，直到连续两次质量损失不变，发酵中止。

1.3.2发酵过程中指标的测定生物量的测定：每24h 取样，利用分光光度法测定样品在波长560nm 处的吸光度值；H 2S 产量的测定[8]：每8h 取样，利用H 2S 检测管测定样品中H 2S 的产量。

1.3.3发酵后指标的测定挥发酸含量的测定：参照国标GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》进行测定。

1.3.4数据分析采用SPSS 20.0软件进行数据分析处理，采用Duncan 检验法进行方差分析，采用Pearson 相关分析进行相关性分析，双侧检验计算线性相关关系的显著性，每组实验重复3次。