高脂血症对脑缺血再灌注损伤大鼠海马GFAP和bFGF表达的影响

高脂血症对脑缺血再灌注损伤大鼠海马GFAP和bFGF表达的影响张小良1,2,任占川2,高赛红1,李瑞梅2,杨迎春2摘要:目的观察高脂血症对大鼠脑缺血再灌注损伤后大脑海马胶质纤维酸性蛋白(GFAP)㊁碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的影响,探讨高脂血症加重脑缺血再灌注损伤的机制㊂方法高脂饮食建立高脂血症模型㊂以线栓法制作大鼠大脑中动脉阻塞的局灶性脑缺血再灌注模型,采用观测神经行为和蛋白印迹法相结合的方法,观测大鼠脑缺血再灌注侧大脑海马CA4区内GFAP和bFGF表达的变化和关系,及神经功能改变㊂结果在相同时间点,高脂血症合并脑缺血再灌注组与单纯脑缺血再灌注组相比GFAP和bFGF阳性表达量均明显降低(P<0.05)㊂GFAP与bFGF表达趋势相似,关联性分析显示正相关(P<0.05)㊂结论高脂血症可能通过同时减少bFGF的表达和GFAP的表达,并产生相互影响减低对脑的保护作用,从而加重脑缺血再灌注损伤㊂关键词:脑缺血再灌注;高脂血症;胶质纤维酸性蛋白;碱性成纤维细胞生长因子中图分类号:R743R255.2文献标识码:A d o i:10.3969/j.issn.16721349.2015.04.027文章编号:16721349(2015)04049703缺血性脑血管病已发展成为当今世界发病率与病死率最高的三大疾病之一,迅速成为国内外研究的热点㊂缺血性脑血管病的危险因素较多,而高血脂㊁高血压是目前已确定的缺血性脑血管病的高危险因素[1]㊂高血脂可以加重脑缺血再灌注损伤,其作用机制非常复杂[2,3],尽管已经做了大量实验研究,但目前仍然没有一个明确有效的治疗措施㊂海马位于大鼠前脑缺血的缺血受染区,是对缺血极敏感区之一㊂前期实验证实,高脂血症通过降低大鼠海马胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达和减少星形胶质细胞的数量[4],影响碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的分泌使其减少[5],从而减弱脑缺血再灌注损伤后的神经保护作用加重损伤㊂根据上述提示,本实验拟在高脂血症合并脑缺血再灌注损伤大鼠的海马CA4区内,探讨GFAP和bFGF 的表达的关联性,为临床研究高脂血症加重缺血性脑病的机制提供理论参考㊂1材料与方法1.1动物和主要试剂健康成年雄性SD大鼠60只,体重160g~180g,清洁级,购于山西医科大学实验动物中心㊂随机分为高脂血症合并脑缺血再灌注组(24只)㊁脑缺血再灌注组(24只)和假手术组(12只)3组㊂前两缺血组均又分为缺血2h再灌注1d㊁3d㊁7d㊁14 d4组,每组6只㊂GFAP抗体购自博士德公司;bFGF抗体购自Santa Cruz Biotechnology,USA;SP试剂盒购自北京博奥森公司;蛋白提取试剂盒购自北京普利莱公司;作者单位:1.山西医科大学(太原030001);2.山西医科大学汾阳学院通讯作者:任占川,E mail:r88001@ βactin购自北京中杉金桥生物有限公司;荧光素标记羊抗兔IgG(Goat anti rabbit IgG/TRITC)购自博奥森生物技术有限公司;Beyo ECL,Western荧光检测试剂购自碧云天生物技术公司㊂1.2动物模型制作与取材1.2.1高脂血症模型参考杨庆等[6]所设计的高脂饲料配方,基础饲料为84%㊁加胆固醇3%㊁胆盐0.5%㊁猪油10%㊁蛋黄粉2.5%,大鼠自由采食于4周~6周后,断尾采血,运用半自动生化分析仪[CAl71(A),上海合意],测定高密度脂蛋白㊁低密度脂蛋白㊁总胆固醇㊁三酰甘油值㊂高脂饮食组与正常饮食组比较,所测指标差异有统计学意义,确定模型成功㊂1.2.2大鼠脑缺血再灌注模型参考Nagasawa等[7]和Longa等[8]的方法,在颈部正中切开皮肤,分离出左侧颈总动脉(CCA)㊁颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)㊂在ECA游离段剪一小口,将鱼线插入,经CCA分叉处进入ICA至中动脉,插入长度为18mm~ 20mm㊂扎紧备线,外留1cm长线头㊂缺血2h后,拔出鱼线使其头端沿颈内动脉回到颈外动脉中,即可恢复大脑中动脉(middle cerebral artery,MCA)血供进行再灌注;假手术组鱼线插入长度小于10mm,不阻塞MCA;模型组大鼠按计划的再灌注时间点,假手术组再灌注24h,断头,迅速取脑(视交叉前㊁后2mm之间的冠状脑片)㊂蛋白印迹:于冰上快速新鲜取脑,并剥离取出缺血侧海马,置于-80ħ冰箱保存待用㊂1.3神经功能评分标准依据Longa等[8]评分标准, 0分:正常,无神经损伤症状;1分:对侧前爪部分屈曲或全部屈曲;2分:向偏瘫侧转圈;3分:向偏瘫侧倾倒; 4分:不能自发行走,意识丧失㊂1.4Western blot检测海马中GFAP㊁bFGF蛋白表达㊃794㊃中西医结合心脑血管病杂志2015年4月第13卷第4期依据蛋白提取试剂盒说明将海马组织提取㊁匀浆㊁离心㊁移液㊁90ħ煮沸变性,并利用Barford 法为标准蛋白,按考马斯亮蓝法测蛋白,分装样品待用㊂依次准备SDSPAGE 凝胶,GFAP 分子量大,选择10%凝胶;bFGF 分子量小,选择12%凝胶㊂积层胶5%,分离胶10%,上样量30μg /20μL 加样电泳(60V ,30min ,90V ,40min ),湿转膜(100V ,2h ),加封闭液(PBST 加5%的脱脂奶粉配制)室温放置3h ,加现配好的一抗(GFAP 1ʒ200,bFGF 1ʒ400),βaction (羊抗兔,1ʒ1000)4ħ过夜,辣根过氧化酶标记的IgG (羊抗兔,1ʒ500)室温3h ,暗室内曝光显色㊂1.5 统计学处理 蛋白印迹结果,运用捷达JD 801根据目的条带值的光密度与内参βaction 光密度之比值为半定量,采用SPSS16.0软件包行析因设计和统计学分析,数据以均数ʃ标准差(x ʃs )表示㊂高脂血症模型数据采用两独立样本t 检验,GFAP ㊁bFGF 组间㊁组内比较及关联性分析采用析因分析,P <0.05为差异有统计学意义㊂2 结 果2.1 神经功能评分 假手术组大鼠无异常表现,评分为0分;缺血再灌注组大鼠以右侧前爪部分屈曲或全部屈曲,向右侧转圈为主,评分为1.10分ʃ0.78分㊂高血脂合并缺血再灌注组大鼠以右侧前爪部分屈曲或全部屈曲,向右侧转圈并倾倒,评分为2.00分ʃ0.53分㊂高脂血症合并脑缺血再灌注组㊁单纯缺血再灌注组与假手术组比较差异有统计学意义(P <0.05);高脂血症合并脑缺血再灌注组与单纯脑缺血再灌注组比较差异有统计学意义(P <0.05)㊂2.2 western blot 检测GFAP 在不同时间的表达 蛋白印迹结果以光密度值为半定量用图像分析软件进行分析,根据目的条带值与内参βaction 条带值之比进行分析㊂假手术组GFAP 特异性蛋白条带不明显,在同一时间点内高脂血症脑缺血再灌注组蛋白含量均明显低于单纯脑缺血再灌注组(P <0.05)㊂详见表1㊁图1㊁图2㊂表1 不同再灌注时间GFAP 表达水平比较(x ʃs )组别n假手术组1d 3d 7d14d高脂血症合并脑缺血再灌注组60.25ʃ0.300.51ʃ0.031)1.02ʃ0.261)1.60ʃ0.161)0.37ʃ0.071)单纯脑缺血再灌注组60.41ʃ0.010.78ʃ0.731)2) 2.55ʃ0.361)2)1.94ʃ0.101)2)0.64ʃ0.041)2)与假手术组比较,1)P <0.05;与高脂血症合并脑缺血再灌注组比较,2)P <0.05㊂ 注:1为高脂血症合并脑缺血再灌注组,2为单纯脑缺血再灌注组; 注:1㊁2㊁3㊁4㊁5依次代表sham 为1d ㊁3d ㊁7d ㊁14d ㊂sham 为假手术组㊂图1 海马GFAP 蛋白印迹表达 图2 海马GFAP 蛋白印迹表达线图2.3 western blot 检测bFGF 在脑缺血再灌注后不同时间的表达 bFGF 同一分组内1d ㊁3d 条带相对较深较粗,7d ㊁14d 相对较浅较细㊂在相同时间点,高脂血症合并脑缺血再灌注组较单纯脑缺血再灌注组各条带浅㊁细㊂详见表2㊁图3㊁图4㊂表4 不同再灌注时间bFGF 表达水平比较(x ʃs )pg/unit组别n假手术组1d 3d 7d14d高脂血症合并脑缺血再灌注组6 1.18ʃ0.02 1.45ʃ0.021)1.83ʃ0.021)1.63ʃ0.031) 1.27ʃ0.041)单纯脑缺血再灌组61.40ʃ0.031.77ʃ0.081)2)2.11ʃ0.191)2)1.92ʃ0.051)2)1.48ʃ0.031)2)与假手术组比较,1)P <0.05;与高脂血症合并脑缺血再灌注组比较,2)P <0.05㊂㊃894㊃C H I N E S EJ O U R N A L O FI N T E G R A T I V E M E D I C I N E O N C A R D I O /C E R E B R O V A S C U L A R D I S E A S E A pr i l 2015 V o l .13 N o .4注:1为高脂血症合并脑缺血再灌注组;2为单纯脑缺血再灌注组;sham 为假手术组㊂图3 bFGF印迹表达注:1㊁2㊁3㊁4㊁5依次代表sham ㊁1d ㊁3d ㊁7d ㊁14d ㊂图4bFGF 印迹表达线图2.4 GFAP 与bFGF 相关性分析 GFAP 与bFGF 的曲线走向非常相似,各组在1d 开始上升,3d 达高峰值,7d ㊁14d 呈下降趋势,统计分析结果显示GFAP 与bFGF 之间存在显著正相关(r =0.05)㊂3 讨 论GFAP 是星形胶质细胞的特异标志性蛋白[9],在正常情况下只有少数表达,而在缺血后的反应型活化胶质细胞中增多[10],其表达的量可反映星形胶质细胞的功能状态[11]㊂GFAP 被公认为星形胶质细胞的成熟标志㊂星形胶质细胞在中枢神经系统的代谢和营养㊁维持正常神经元功能等方面起着重要作用[12,13]㊂实验已经证实高血脂会影响星形胶质细胞分泌GFAP ,降低神经保护作用而加重脑缺血再灌注损伤㊂bFGF 本质是丝裂原,由胶质细胞刺激DNA 合成,能促进多种细胞进行有丝分裂,对促血管生成起着关键作用㊂当损伤时,bFGF 在胶质细胞表达增多,使其胞大增生,进一步迁移,形成活化的星形胶质细胞完成神经保护作用[14]㊂对维护中枢神经系统正常功能起着重要作用,被公认为是最有效的神经营养因子㊂正常成熟CNS 的bFGF 主要来自AS ,GFAP 是动脉粥样硬化(AS )所独有的细胞骨架蛋白,由此推想bFGF 与GFAP 之间应该存在关联性㊂已有实验证实,bFGF 对GFAP 有促进和上调作用,bFGF 对中枢神经系统的保护作用是通过调节GFAP 来实现的㊂高血脂可明显降低bFGF 浓度,降低脑缺血后脑自身的保护作用[1517]㊂本实验通过bFGF 与GFAP 的关联性分析可知,bFGF 与GFAP 具有正相关性,关联系数为0.5㊂得出高血脂加重脑缺血再灌注损伤不仅通过单独降低bFGF ㊁GFAP 产生作用;高血脂还可能通过减少bFGF 的表达,引起GFAP 表达的减少,下调星形胶质细胞在中枢神经系统的保护作用;同时通过减少GFAP 的表达,下调CNS 内bFGF 的神经保护作用,进而加重脑缺血再灌注损伤㊂综上所述,在临床上检测患者的bFGF 和GFAP 蛋白的表达及调节㊁干预bFGF 和GFAP 蛋白量的表达,可以提高脑神经保护作用减轻高血脂合并脑缺血再灌注损伤,具体如何调节还需更多理论及实验研究证实㊂参考文献:[1] 任秀君,施昱丞,图娅,等.电针对高血脂合并脑缺血大鼠血脂及神经生长因子影响的实验研究[J ].针刺研究,2007,32(1):2428.[2] 赵军,王翔宇,汪香君,等.缺血性脑血管病的危险因素[J ].中华现代内科学杂志,2007,4(1):5152.[3] 王颖,赵德山,何邦平.脑中风高危人群血液流变学的改变[J ].中华内科杂志,1995,34(4):252254.[4] 任占川,李瑞梅,杨迎春.高血脂对大鼠脑缺血再灌注损伤后海马内胶质纤维酸性蛋白表达的影响[J ].解剖学杂志,2011,34(6):766769.[5] 任占川,李瑞梅,杨迎春,等.高血脂对大鼠脑缺血再灌注损伤后海马内bFGF 表达的影响[J ].神经解剖学杂志,2013,29(4):440444.[6] 杨庆,梁日欣,叶锦霞,等.红花提取物对高脂血症模型大鼠降血脂作用和安全性实验研究[J ].中国实验方剂学杂志,2007,13(11):3033.[7] Nagasawa H ,Kogure K .Correlation between cerebral blood flow and histologic changes in a new rat model of middle cerebral ar -tery occlusion [J ].Stroke ,1989,20(8):10371043.[8] Longa EZ ,Weinstein PR ,Carlson S ,et al .Reversible middle cerebral artery occlusion without caraniectomy in rats [J ].Stroke ,1989,20(1):8491.[9] Pehar M ,Cassina P ,Vargas MR ,et al .Astrocytic production of nerve growth factor in motor neuron apoptosis :Implications foramyotrophic lateral sclerosis [J ].Neurochem ,2004,89(2):464473.[10] Kiprianova I ,Sandk ühler J ,Schwab S.Brain derived neurotro -phic factor improves long term potentiation and cognitive func -tions after transient forebrain ischemia in the rat [J ].Exp Neurol ,1999,159(2):511519.[11] Sun Y ,Jin K ,Xie L ,et al .VEGF induced neuroprotection ,neu -rogenesis ,and angiogenesis after focal cerebral ischemia [J ].Clin Invest ,2003,111(12):18431851.[12] 张志军,吴利平,万群,等.缺血再灌注对大鼠神经元与星形胶质细胞的影响[J ].神经解剖学杂志,2005,21(6):611614.[13] 钱贻崧,关腾,汤旭螓,等.星形胶质细胞与缺血性损伤[J ].中国新药杂志,2008,17(11):897900.[14] 黄兴锐,朱云霞,赵爱琴,等.碱性成纤维细胞生长因子对小鼠创伤性脑损伤后神经元凋亡及星形胶质细胞活化的影响[J ].解剖学报,2009,40(5):720723.[15] Gomes FC ,Paulin D ,Moura Neto V.Glial fibrillary acidic protein (GFAP ):Modulation by growth factors and its implication in as -trocyte differentiation [J ].Braz J Med Biol Res ,1999,32(5):619631.[16] Rom ão LF ,Sousa Vde O ,Neto VM ,et al .Glutamate activates GFAP gene promoter from cultured astrocytes through TGF be -ta 1pathways [J ].Neurochem ,2008,106(2):746756.[17] Niidome T ,Nonaka H ,Akaike A ,et al .Basic fibroblast growth factor promotes the generation of microtubule associated pro -tein 2positive cells from microglia [J ].Biochem Biophys ResCommun ,2009,390(3):10181022.(收稿日期:20141006)(本文编辑郭怀印)㊃994㊃中西医结合心脑血管病杂志2015年4月第13卷第4期。