脑缺血再灌注损伤治疗的实验研究进展_王富明

主要来源。目前大多数研究者认为半胱氨酸蛋白酶 caspase 家族参与了线粒体相关凋亡的过程。与脑缺 血有关的 caspase 家族成员有 caspase － 3、caspase － 8、caspase － 9、caspase － 12 等。另外一个线粒体相关 凋亡蛋白家族包括促凋亡蛋白（ Bad、Bax、Bim） 以及 抗凋亡蛋白（ Bcl － 2、Bcl － xl、Bcl － w） 。它们通常被 认为是通过线粒体内膜的通透性调节细胞凋亡。B 淋巴细胞瘤 － 2 基因（ B － cell lymphoma － 2，Bcl － 2） 是细胞凋亡研究中最受重视的癌基因之一。凋亡诱 导因子（ apoptosis － inducing factor，AIF） 也是线粒体 相关蛋白，可以通过细胞核和细胞质两条通路激活凋 亡信号［9］。线 粒 体 通 路 是 目 前 研 究 较 多，也 较 为 透 彻的信号路径，也是目前研究的热点。
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与其他分子如 DNA 和脂质反应十分活跃，通过与单 个电子配对而引起上述物质的氧化。当氧气获得一 个额外的电子后，就会形成超氧阴离子，使分子多一 个未配对的电子。CIＲI 后会产生多种氧自由基及其 派生物，主要包括以下两类： （ 1） 属于氧自由基系列， 包括超氧阴离子（ O2－ ） ，羟基自由基（ OH － ） 等。其主 要产生于线粒体中，约 2% ～ 5% 的电子流是由其形 成的。（ 2） 脂质自由基系列，包括烷自由基、烷氧自 由基以及脂质过氧化物自由基等。脑缺血再灌注损 伤后，机体活性氧系统和抗氧化系统之间的平衡被打 破时会对神经系统产生较为严重的损害作用。在脑 缺血早期，脑血管局部血液灌注明显减少，导致缺氧 并产生脑损伤。随后的再灌注过程，酶和线粒体将氧 作为底物产生大量的氧自由基。多基因脂肪酸脂质 过氧化过程中过氧化分解的终末产物如丙二醛（ malondiadehyde，MDA） 对很多细胞结构，如脂质成分、细 胞膜、蛋白成分以及 DNA 等产生损伤。
四、细胞内外信号通路调节药物 目前研究发现，有很多细胞内外信号调解通路参 与了 CIＲI 的过程。其中之一是 EＲK 途径，它是细胞 外信号调节激酶 1 /2 （ extracellular signal regulated kinase 1 /2，EPK1 /2） ，也是丝裂原活化蛋白激酶家族 的 （ mitogen － activated proteinkinase，MAPK ） 一 种。 激活的 MAPKs 通过磷酸化多种转录因子、细胞骨架 相关蛋白和其他酶类等多种蛋白底物来调节多种细 胞生理过程，参与细胞死亡等生理过程，它也被称为 细胞外信号引起细胞核反应的共同通路。脑缺血后， 细胞的缺血缺氧通过三级级联反应激活 EＲK 通路， 导致其表达升高。和脑缺血相关的细胞通路抑制剂 包括 JNK（ c － Jun N － terminal kinase） 抑制剂、SphK （ sphingosine kinase） 抑制剂等［14 ～ 16］。这些蛋白激酶 的抑制剂可以改善 CIＲI 后脑梗死体积，减轻脑水肿 发 生 ，改 善 神 经 功 能 评 分 。 其 作 用 机 制 或 与 血 脑 屏 障 的 修 复 有 关 ，或 与 内 皮 细 胞 离 子 通 道 的 开 放 以 及 水通道蛋白的表达有关。还有研究表明其作用机 制 与 细 胞 的 凋 亡 和 抑 制 炎 性 反 应 相 关 ，或 者 是 两 个 或 者 多 个 机 制 共 同 作 用 的 结 果 。 总 之 ，其 具 体 的 机 制 目 前 研 究 不 是 特 别 明 确 ，因 此 其 临 床 应 用 尚 需 进 一步验证。 五、中药、针刺的抗氧化作用 中医中药在治疗脑缺血再灌注损伤中起到重要 作用。中药单方、复方制剂以及针刺疗法等可能通过 ·14·
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J Med Ｒes，Feb 2015，Vol． 44 No． 2
些炎性因子的抑制剂被认为可以减少脑组织的梗死 面积。在众多的炎症相关分子中，NF － κB 是一个重 要的调节分子，主要在神经元、星形胶质细胞、小胶质 细胞以及炎性细胞中表达。多种 NF － κB 抑制剂被 认为可以减少炎性因子的表达，从而减少 CIＲI 后脑 组织的损伤［11，12］。另外，Toll 样受体（ TLＲs） 是一种 表达在如 B 细胞、树突状细胞、小胶质细胞以及血管 内皮细胞、星形胶质细胞很多免疫细胞等和神经元等 细胞的一种跨膜蛋白。根据其不同作用，大致可以分 为 4 型。 TLＲs 的 激 活 被 认 为 和 炎 症 密 切 相 关。 TLＲ2 和 TLＲ4 因其在 CIＲI 中的重要作用而备受关 注，两者可以分泌大量的炎性细胞因子，如 IL － 23、IL － 17、TNF － α 和 COX － 2 等［13］。因此 TLＲs 的抑制 剂被认为有抗炎作用。但是鉴于炎症在 CIＲI 中的作 用机制较为复杂，尤其是其瀑布级联反应，不是单一 的控制某一个反应，或者抑制某一个分子就可以达到 控制神经炎症的目的。因此找到有效的控制神经炎 症的方法还需要进一步探索和尝试。
DOI 10． 3969 / j． issn． 1673-548X． 2015． 02． 004
脑卒中是最常见的一种疾病。根据 2013 年《中 国卫生和计划生育统计年鉴》，脑血管疾病可能引起 高病死率和致残率，已经位居中国城市居民死亡原因 的第 3 位，对 人 类 的 健 康 造 成 了 严 重 威 胁。 大 约 80% ～ 85% 的脑卒中患者属于缺血性脑卒中［1］。因 此探索脑缺血再灌注损伤（ cerebral ischemia reperfusion injury，CIＲI） 的机制和找到有效的治疗手段是目 前的研究重点。组织纤溶酶原激活物 TPA 是目前唯 一的 FDA 批准的治疗脑缺血的药物，主要作用于堵 塞的血管再通并使之再灌注，但因其适应证、禁忌证 的限制，导致临床上多数患者无法使用该药物。而且 CIＲI 后的细胞损伤主要由于再灌注引起的，并且随 之而来 的 细 胞 色 素 C 的 释 放、caspase － 3 的 激 活、 DNA 的破碎最终导致了细胞的凋亡。因此，TPA 的 治疗时间窗、禁忌证以及再灌注引起的细胞损伤使其 在临床的应用受限。因此本文从 CIＲI 发生的机制入 手，探讨可能的治疗手段。
三、炎症抑制剂 脑缺血后的氧和葡萄糖供应不足，导致了脑缺血 区域神经元和炎症细胞的损伤以及代谢产物的集聚。 受损的神经元和炎性细胞通过释放炎性因子，如肿瘤 细胞因子 － α（ tumor necrosis factor － α，TNF － α） 、白 细胞介素 － 1β（ interleukin － 1β，IL － 1β） 、白细胞介 素 － 6（ interleukin － 6，IL － 6） 等，进一步促进黏附分 子的表达和炎性因子的募集。最终导致缺血区域血 管内皮的渗出和血脑脊液屏障结构的破坏。因此这
医学研究杂志 2015 年 2 月 第 44 卷 第 2 期
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2． 人工合成抗氧化剂： 依达拉奉是目前临床上应 用较广的脑缺血后静脉用药，也是一种氧自由基清除 剂，有报道指出，其可以通过干扰脂质氧化，改善线粒 体水肿，提高内皮型一氧化氮合酶 （ endothelial nitric oxide synthase，eNOS） 的表达，增加脑血流量，减少自 由基形成，降 低 脑 梗 死 面 积，防 止 神 经 元 迟 发 性 损 伤［5］。不 仅 如 此，其 还 有 抗 凋 亡、抗 细 胞 坏 死、抗 炎 作用。临床报道也指出应用该药物治疗脑梗死患者， 可以改善脑缺血患者的脑水肿以及预后。因此在日 本和中国其应用较为广泛。除此之外，另一种抗氧化 的研究也较多。在中枢神经系统，氧自由基可以由很 多分子以及结构产生，比如线粒体、黄嘌呤氧化酶、非 偶合一氧化氮合酶以及环氧酶等。然而，只有 NAPDH 氧化酶是专一的产生 ＲOS 的酶类。与脑缺血有 关的 NAPDH 氧化酶尤其是第 4 类磷酸酰胺腺嘌呤 二核苷酸氧化酶［type 4 nicotinamide adenine dinucleotide phosphate （ NADPH） oxidase，NOX4］，其表达主 要分布在神经元［6］。NOX4 敲除的小鼠的脑梗死体 积明显减少（ 75% ） ，其作用与应用 NOX 抑制剂的小 鼠相似［7］。因此抑制 NOX4 的药物可能为缺血再灌 注损伤脑组织提供保护作用。有报道称，酪蛋白激酶 2（ CK2） 是 NADPH 氧化酶的重要调节剂，CK2 在脑 组织的失活可以通过增加 NADPH 氧化酶（ 第 2 类磷 酸酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶，NOX2） 的活动，增加 ＲOS 类物质的产生以及神经元的死亡。使用 CK2 抑 制剂的大鼠脑组织中脑梗死面积明显增加，并且其作 用可以 被 NADPH 氧 化 酶 抑 制 剂 apocynin 削 弱［8］。 目前 NADPH 氧化酶的研究较多，但是不同的亚基表 达的部位不同，有些亚基表达在脑组织，并且各个脑 区的分布 也 不 太 一 样。根 据 目 前 文 献，COX2 是 在 CIＲI 中最为重要的一种。因此 COX2 抑制剂有望成 为特异性的治疗脑缺血的抗氧化药物。
应以及细胞信号调亡抑制剂、抗炎、干扰细胞信号调节的药
物以及中医药针灸等，可以缓解脑缺血再灌注损伤。本文综述了脑缺血再灌注损伤相关的实验研究，为临床脑缺血患者的治疗
提供实验依据。
关键词 脑缺血再灌注损伤 机制 治疗
中图分类号 Ｒ255． 2
文献标识码 A
一、抗氧化剂 脑是机体代谢率最高的器官，且大部分是通过有 氧代谢得到能量。正常情况下，活性氧和抗氧化系统 之间处于平衡状态。在某种情况下，机体的氧化 － 抗 氧化系统失衡时，机体产生过多的氧化应激产物即活 性氧，也被称为氧自由基。自由基是一类包含一个或 多个与分子的内部未配对电子的分子。这些自由基
基金项目： 国家自然科学基金资助项目（ 81273850） 作者单位： 100730 中国医学科学院 / 北京协和医学院北京协和医 院中医科 通讯作者： 孙华，主任医师，博士生导师，电子信箱： sunhuahe@ vip． sina． com
caspase 抑制剂可能会对凋亡有抑制作用，从而 减缓 CIＲI 损伤。有研究者在大鼠脑缺血 － 再灌注实 验中，证明 高 压 氧 预 适 应 能 减 轻 脑 损 伤 和 细 胞 凋 亡 率，提高细胞色素 C（ Cyc － C） 水平和降低 caspase 酶 类活性，说明了高压氧预适应对脑缺血 － 再灌注的保 护作用可能与抑制线粒体凋亡通路有关［10］。在目前 的动物实验中，凋亡抑制剂途径被认为是值得研究的 针对 CIＲI 的有效方法。有研究者对大鼠进行腹腔 caspase － 3 抑制剂 Z － Asp － Val － Fluoromethyl Ketone（ Z － DEVD － FMK） 注射，治疗 4 天和 14 天后观 察动物一般生命体征，神经功能评分，脑缺血区域体 积，缺血皮质 caspase － 3 表达以及细胞凋亡的情况。 证明 caspase － 3 抑制剂可以明显改善动物的神经功 能评分、梗死体积以及细胞凋亡。根据目前的研究结 果，大多数文献支持，海马区 CA1、CA2 是 CIＲI 后容 易产生损伤的脑区。就发生时间来说，相对于海马的 （ 48 ～ 96h） ，纹状体在 CIＲI 后的损伤往往要比海马 提前（ 数小时内） 。实际上，很多影响因素包括实验 动物、损伤的模型、再灌注的时间等都会影响实验的 结果。因此今后的研究需要根据不同的实验目的，选 取不同的动物模型，不同损伤区域进行研究。
1． 天然抗氧化物质： 人体存在许多直接的抗氧化 物质如自由基代谢酶，包括超氧 化 物 歧 化 酶 （ super oxide dismutase，SOD） 、过氧化氢酶（ catalase，CAT） 、 谷胱甘肽过氧化物酶等，抗氧化剂包括维生素 E、维 生素 C 等。细胞本身也能合成一部分抗氧化剂，如 谷胱甘肽等。除了直接作用的抗氧化物质，还包括间 接作用的抗氧化剂如金属络合剂，将体内不断生成的 自由基清除，维持机体的动态平衡。天然植物中也 存在有很多具有抗氧化作用的成分。有人从银杏中 提取出一种阿拉伯类型多糖（ GBPw） ，从多种食物中 提出多酚类成分，苦豆子提取物氧化槐定碱等均证明 天然植物提取物对脑缺血动物具有抗氧化作用［2 ～ 4］。
二、细胞凋亡抑制剂 凋亡被认 为 是 一 种 程 序 性 死 亡，根 据 目 前 的 研 究，主要有 3 种引起细胞凋亡的通路： 线粒体通路、内 质网通路和死亡受体通路。其中对线粒体通路的研 究最为深入和透彻。线粒体是 ＲOS 产 生 的 主 要 场 所，在正常的情况下，它们对机体起防御作用，脑缺血 时线粒体易成为 ＲOS 攻击的靶点，导致自由基攻击 磷脂膜以及膜电位的变化，干扰其产生 ATP 的氧化 磷酸化过程。另外，谷氨酸兴奋性中毒、缺血后低氧、 Ca2 + 超载等均会刺激缺血后受损的线粒体 ＲOS 的产 生。存在于线粒体内膜上的呼吸链是内源性 ＲOS 的
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J Med Ｒes，Feb 2015，Vol． 44 No． 2
脑缺血再灌注损伤治疗的实验研究进展
王富明 徐 虹 孙 华
摘 要 在脑缺血再灌注损伤过程中，脑组织的缺血缺氧导致氧化应激反应，产生的氧自由基可通过某些途径如脂质过氧
化、蛋白质变性造成细胞坏死； 线粒体、内质网途径、死亡受体途径的激活及直接的 DNA 损伤等导致细胞凋亡； 炎症瀑布级联反