pBMTB-1广宿主载体使用说明
真核细胞常见的表达载体及真核细胞表达外源基因的调控
真核细胞常见表达载体1. pCMVp-NEO-BAN载体特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2. pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。
Excitation maximum = 488 nm; Emission maximum = 507图示为启动子分泌信号肽和多克隆位点区域：Ase1.pCMV…ccg cta gcg cta ccg gtc gcc acc atg- .EGFP…BamH1…SV40 poly A+ Nhe1 Age13. pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV 启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体构建的基本步骤
载体构建
一、原理
依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
二、操作步骤
5、载体与目的基因连接
如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接。
置于温箱，12-16℃，保温8-16h
6、转化（连接产物转化到感受态细胞中）
依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃，
12-16h。
7、单克隆检测
（1）挑单克隆
先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的
AMP，用枪头混匀；取1.5mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种。
pBV220大肠杆菌表达载体说明
pBV220⼤肠杆菌表达载体说明pBV220编号名称北京华越洋VECT--‐110 pBV220pBV220载体基本信息载体名称: pBV220质粒类型: 原核表达载体，温控型表达载体，热诱导表达载体⾼拷贝/低拷贝: ⾼拷贝启动⼦: pR/pL克隆⽅法: 多克隆位点，限制性内切酶载体⼤⼩: 3666 b p5' 测序引物及序列: pBV220--‐F: 5?′--‐AAGAAGGGCAGCATTCAAAG--‐3‘3' 测序引物及序列: pBV220--‐R: 5?′--‐CTGCGTTCTGATTTAATCTG--‐3‘载体标签: --‐--‐载体抗性: 氨苄筛选标记: --‐--‐备注: pBV220质粒的SD sequence（⽤于结合原核⽣物核糖体的序列）后紧跟多克隆酶切位点，便于插⼊带起始ATG的外源基因，可表达⾮融合蛋⽩。
载体含有强的转录终⽌⼦可防⽌出现"通读"现象，有利于质粒--‐宿主系统的稳定。
载体pBV220为3.7Kb，有利于增加其拷贝数及容量。
pBV220含有PL启动⼦和编码对该启动⼦具有抑制作⽤⽽⼜对温度敏感的cI蛋⽩基因cIts857调控基因cI，因此可⽤温度对插⼊其中的外源基因的转录进⾏调控。
温控型原核表达载体，⾼拷贝数，⼤容量，强启动⼦，强转录终⽌⼦，可在任何受体菌中诱导表达。
pBV220载体是λPL/PR--‐cI857温度敏感系统表达载体，能够在42 表达⾮融合的⽬的蛋⽩。
在利⽤pBV220载体进⾏质粒构建的时候，需要加⼊ATG起始密码⼦。
PBV220质粒属于温度诱导表达型，培养温度为30 ，诱导温度为42 。
稳定性: 诱导表达组成型: ⾮组成型病毒/⾮病毒: ⾮病毒pBV220载体质粒图谱和多克隆位点信息Ampr, 氨苄抗性基因;ori, 质粒复制起点;cIts857, lambda 噬菌体表达抑制基因，但是在热诱导条件下能够表达⽬的基因; PRPL, 来⾃于lambda 噬菌体的串联的PR和PL启动⼦，保证基因的⾼⽔平表达; SD, Shine-Dalgarno序列;rrnB, 核糖体rrnB基因，是基因转录终⽌信号;pBV220载体简介pBV220载体是我国预防医学科学院病毒研究所⾃⾏构建的⼤肠杆菌温控表达载体,⽬前仍在⼴泛使⽤.pBV220载体序列ORIGIN1 GAATTCCCGG GGATCCGTCG ACCTGCAGCC AAGCTTCTGT TTTGGCTTAT GAGAGAAGAT 61 TTTCAGCCTG ATACAGATTA AATCAGAACG CAGAAGCGGT CTGATAAAAC AGAATTTGCC 121 TCCCGGCAGT AGCGCGGTGG TCCCACCTGA CCCCATGCCG AACTCAGAAG TGAAACGCCG 181 TAGCGCCGAT GGTAGTGTGG GGTCTCCCCA TGCGAGAGTA GCCAACTGCC AGGCATCAAA 241 TAAAACGAAA GGCTCAGTCG AAAGACTGGG CCTTTCGTTT TATCTGTTGT TTGTCGGTGA 301 ACGCTCTCCT GAGTAGGACA AATCCGCCGG GAGCGGATTT GAACGTTGCG AAGCAACGGC 361 CCGGAGGGTG GCGGGCAGGA CGCCCGCCAT AAACTGCCAG GCATCAAAGG AATCAGAAGG 421 CCATCCTGAC GGATGGCCTT TTTGCGTTTC TACAAACTCT TTGTTTATTT TTCTAAATAC 481 ATTCAAATAT GTATCCGCTC ATGAGACAAT AACCCTGATA AATGCTTCAA TAATATTGAA 541 AAAGGAAGAG TATGAGTATT CAACATTTCC GTGTCGCCCT TATTCCCTTT TTTGCGGCAT 601 TTTGCCTTCC TGTTTTTGCT CACCCAGAAA CGCTGGTGAA AGTAAAAGAT GCTGAAGATC 661 AGTTGGGTGC ACGAGTGGGT TACATCGAAC TGGATCTCAA CAGCGGTAAG ATCCTTGAGA 721 GTTTTCGCCC CGAAGAACGT TTTCCAATGA TGAGCACTTT TAAAGTTCTG CTATGTGGCG 781 CGGTATTATC CCGTGTTGAC GCCGGGCAAG AGCAACTCGG TCGCCGCATA CACTATTCTC 841 AGAATGACTT GGTTGAGTAC TCACCAGTCA CAGAAAAGCA TCTTACGGAT GGCATGACAG 901 TAAGAGAATT ATGCAGTGCT GCCATAACCA TGAGTGATAA CACTGCGGCC AACTTACTTC 961 TGACAACGAT CGGGAGGACCGAAGGAGCTA ACCGCTTTTT TGCACAACAT GGGGGATCAT 1021 GTAACTCGCC TTGATCGTTG GGAACCGGAT CTGAATGAAG CCATACCAAA CGACGAGCGT 1081 GACACCACGA TGCCTGTAGC AATGGCAACA ACGTTGCGCA AACTATTAAC TGGCGAACTA 1141 CTTACTCTAG CTTCCCGGCA ACAATTAATA GACTGGATGG AGGCGGATAA AGTTGCAGGA 1201 CCACTTCTGC GCTCGGCCCT TCCGGCTGGC TGGTTTATTG CTGATAAATC TGGAGCCGGT 1261 GAGCGTGGGT CTCGCGGTAT CATTGCAGCA CTGGGGCCAG ATGGTAAGCC CTCCCGTATC 1321 GTAGTTATCT ACACGACGGG GAGTCAGGCA ACTATGGATG AACGAAATAG ACAGATCGCT 1381 GAGATAGGTG CCTCACTGAT TAAGCATTGG TAACTGTCAG ACCAAGTTTA CTCATATATA 1441 CTTTAGATTG ATTTAAAACT TCATTTTTAA TTTAAAAGGA TCTAGGTGAA GATCCTTTTT 1501 GATAATCTCA TGACCAAAAT CCCTTAACGT GAGTTTTCGT TCCACTGAGC GTCAGACCCC 1561 GTAGAAAAGA TCAAAGGATC TTCTTGAGAT CCTTTTTTTC TGCGCGTAAT CTGCTGCTTG 1621 CAAACAAAAA AACCACCGCT ACCAGCGGTG GTTTGTTTGC CGGATCAAGA GCTACCAACT 1681 CTTTTTCCGA AGGTAACTGG CTTCAGCAGA GCGCAGATAC CAAATACTGT CCTTCTAGTG 1741 TAGCCGTAGT TAGGCCACCA CTTCAAGAAC TCTGTAGCAC CGCCTACATA CCTCGCTCTG 1801 CTAATCCTGT TACCAGTGGC TGCTGCCAGT GGCGATAAGT CGTGTCTTAC CGGGTTGGAC 1861 TCAAGACGAT AGTTACCGGA TAAGGCGCAG CGGTCGGGCT GAACGGGGGG TTCGTGCACA 1921 CAGCCCAGCT TGGAGCGAAC GACCTACACC GAACTGAGAT ACCTACAGCG TGAGCATTGA 1981 GAAAGCGCCA CGCTTCCCGA AGGGAGAAAG GCGGACAGGT ATCCGGTAAG CGGCAGGGTC 2041 GGAACAGGAG AGCGCACGAG GGAGCTTCCA GGGGGAAACG CCTGGTATCT TTATAGTCCT 2101 GTCGGGTTTC GCCAACCTCT GACTTGAGCG TCGATTTTGT GATGCTCGTC AGGGGGGCGG 2161 AGCCTATGGA AAAACGCCAG CAACGCGGCC TTTTTACGGT TCCTGGCCTT TTGCTGGCCT 2221 TTTGCTCACA TGTTCTTTCC TGCGTTATCC CCTGATTCTG TGGATAACCG TATTACCGCC 2281 TTTGAGTGAG CTGATACCGC TCGCCGCAGC CGAACGACCG AGCGCAGCGA GTCAGTGAGC 2341 GAGGAAGCGG AAGAGCGCCC TTATCTTTCC CTTTATTTTT GCTGCGGTAA GTCGCATAAA 2401 AACCATTCTT其他⼤肠杆菌表达载体：pBV221 ptdTomato pET--‐52b(+) pAmCyan pDsRed--‐Express2 pBV220 pCold--‐GST pColdS--‐SUMO pCold T F pCold I V pCold I II pCold I IpCold I pE--‐SUMO pCold--‐ProS2 pBAD102/D--‐TOPO pBAD202/D--‐TOPO pACYC184 pBAD/Thio--‐TOPO pBad/Myc--‐His C pBad/Myc--‐His B pBad/Myc--‐His A pBad/His C pBad/His B pBad/His A pBAD--‐TOPO pET--‐23b(+) pET--‐23a(+) pET--‐23c(+) pET--‐23(+) pET--‐12b(+) pET--‐12c(+)pET--‐12a(+) pET--‐11b(+) pET--‐11a(+) pET--‐11c(+) pBad24 pQE--‐82L pQE--‐81L pQE--‐80LpQE--‐32 pQE--‐9 pQE--‐16 pQE--‐31pQE--‐60 pQE--‐70 pQE--‐40 pET--‐51b(+)pET--‐50b(+) pET--‐49b(+) pET--‐48b(+) pET--‐47b(+)pET--‐26b(+) pET--‐32a(+) pET--‐21b(+) pET--‐22b(+)pET--‐14b pET--‐16b pET--‐15b pET--‐19bpET--‐20b(+) pET--‐21d(+) pET--‐21c(+) pET--‐21b(+)pET--‐21a(+) pET--‐24a(+) pET--‐24d(+) pET--‐25b(+)pET--‐27b(+) pET--‐28a(+) pET--‐30a(+) pET--‐42a(+)pET--‐43.1c(+) pET--‐43.1b(+) pET--‐43.1a(+) pET--‐44a(+)pET--‐44c(+) pET--‐46 E K/LIC pET--‐37b(+) pTrcHis2 C pTrcHis2 B pTrcHis2 A pET303/CT--‐His pET302/NT--‐His pRSET--‐CFP pRSET--‐EmGFP pRSET--‐BFP pGFPuvpET300/NT--‐DEST pET301/CT--‐DEST pGEM--‐T pBad43pGEX--‐4T--‐3 pGEX--‐5X--‐2 pBlueScript S K(+) pG--‐Tf2pG--‐KJE8 pGro7 pET--‐SUMO pSE380pET--‐17b pET102/D--‐TOPO pCDFDuet--‐1 pMAL--‐p5xpTf16 pET--‐28c(+) pBluescript I I S K(+) pET--‐30b(+) pSUMO pProEX H Tc pProEX H Tb pProEX H Ta pKD3 pKD13 pKD46 pTYB1pTYB2 pTWIN2 pBluescript I I K S(--‐) pTYB12pMAL--‐p5e pACYCDuet--‐1 pEGM--‐11ZF(+) pEGM--‐7ZF(+) PinPoint X a--‐3 PinPoint X a--‐2 PinPoint X a--‐1 pSP73 pSP64 pTWIN1 pTYB11 pTXB1pET--‐5b(+) pBad/gIII C pBad/gIII B pBad/gIII ApET--‐5a(+) pMal--‐p4X pMal--‐p2G pkk223--‐3pkk232--‐8 pCYB1 pEZZ18 pBAD18pMAL--‐c5x pMal--‐p2E pMal--‐p2X pET--‐44 E K/LIC pET--‐43.1 E K/LIC pET--‐41 E K/LIC pMal--‐c4X pTrcHis BpET--‐31b(+) pET--‐3b(+) pET--‐41a(+) pGEX--‐3XpGEX--‐4T--‐2 pETDuet--‐1 pGEX--‐4T--‐1 pTrc99apET--‐28b(+) pET--‐His pALEX a,b,c pACYC177pBR322 pKD4 pKD20 pMXB10pEcoli--‐6xHN--‐GFPuv pKJE7 pRSET B pGEX--‐KGpGEX--‐2T pRSFDuet--‐1 pCOLADuet--‐1 pTrcHis C pTrcHis A pET--‐41b(+) pET--‐42b(+) pET--‐3a(+) pGEX--‐6P--‐3 pGEX--‐6P--‐2 pGEX--‐6P--‐1 pGEX--‐5X--‐3 pGEX--‐5X--‐1 pGEX--‐2TK pRSET A pMal--‐c2G pMal--‐c2E pMal--‐c2X pRSET C pQE--‐30pET--‐45b(+) pET--‐44b(+) pET--‐42c(+) pET--‐41c(+) pET--‐40b(+) pET--‐33b(+) pET--‐39b(+) pET--‐32 E K/LIC pET--‐32 X a/LIC pET--‐32c(+) pET--‐32b(+) pET--‐30 X a/LIC pET--‐30 E K/LIC pET--‐30c(+) pET--‐29c(+) pET--‐29b(+) pET--‐29a(+) pET--‐24c(+) pET--‐24b(+) pET--‐24(+) pET--‐23d(+) pET--‐11d(+) pBad33。
碧云天的突变试剂盒说明书
基因定点突变试剂盒产品简介：碧云天生产的基因定点突变试剂盒(Site-directed Gene Mutagenesis Kit)可以用于点突变，多个邻近密码子的突变，单个或多个邻近密码子的缺失(deletion)或插入(insertion)。
本试剂盒是一个利用目前最新的基因点突变技术设计而成的试剂盒。
只需通过基于PCR的突变质粒的合成，和基于Dpn I的模板质粒的消化，转化培养以及后续的酶切或测序鉴定，即可得到预期的突变质粒(参考图1)。
累计操作时间不足2小时即可完成基因的定点突变。
参考图1，使用本试剂盒时需要先设计长度通常为30个碱基以上的互补的两个引物，在引物中含有预期的突变位点。
然后以待突变的质粒为模板，用这两个引物进行PCR扩增反应。
这样可以产生含有预期的突变位点的双链质粒，但这个双链质粒中有两个nick位点。
待突变的质粒通常来源于大肠杆菌等细菌，在细菌中会被甲基化修饰，而在体外通过PCR扩增得到的质粒不会被甲基化。
这样用甲基化酶Dpn I处理，可以消化掉待突变的质粒模板，而使通过PCR扩增出来的含有突变位点的质粒被选择性地保留下来。
这样把Dpn I处理过的产物转化细菌后，质粒中有两个nick位点可以被大肠杆菌修复，得到的克隆就会含有预期的突变质粒了。
本试剂盒提供了DH5α甘油菌，可用于感受态细菌的制备。
本试剂盒共可以进行十次基因定点突变反应。
图1. 基因定点突变试剂盒原理图保存条件：-20℃保存，一年有效。
注意事项：需自行配制LB液体培养基和LB平板以用于细菌的培养。
需自行设计和合成用于基因定点突变的引物。
需自备用于细菌转化的试剂。
使用本试剂盒前请先阅读后面的常见问题。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明：1. 引物设计：用于特定基因突变的引物需要单独设计，请参考如下一些基本原则进行设计：(1) 共需设计两条互补的引物。
可以先集中设计一条，然后就可以得到互补的另一条引物。
常用载体构建说明书
常用载体构建说明书步骤：一、基本耗材准备（抗生素、LB液体培养基、LB固体培养基、离心管、枪头、三角瓶）二、制备感受态大肠杆菌三、设计引物四、Pcr扩增五、Pcr产物检测六、Pcr产物回收七、双酶切pcr产物和质粒八、酶切产物回收九、目的基因与载体连接十、转化感受态大肠杆菌十一、单克隆检测十二、测序比对十三、提质粒十四、酶切验证十五、转化感受态农杆菌十六、单克隆检测十七、侵染液配制一、基本耗材准备1、抗生素的制备（抗生素为索来宝公司）常用抗生素Kan（卡那）Amp（氨苄）Rif（利福平）母液浓度：Kan 50mg/ml Amp 100 mg/ml Rif 100 mg/ml工作浓度：Kan 50ng/ul Amp 100 ng/ul Rif 100 ng/ul举例：称取kan固体1g 于注射器中，加入20ml ddH2O，溶解后用过滤器注入灭过菌的离心管中，-20度保存，使用比例1:1000注意：Rif溶解时加入DMSO2、培养基的配制LB液体培养基1000ml 200ml牛肉膏5g 1g蛋白胨10g 2g氯化钠10g 2gLB固体培养基1000ml 200ml牛肉膏蛋白胨氯化钠琼脂粉5g10g10g15g1g2g2g3g120℃高温高压灭菌15-20min，固体培养基冷却后加入相应抗性，加入比例1:1000，然后把培养基倒90cc的培养皿中，一般情况下一个培养皿可倒20ml培养基。
3、离心管、枪头、三角瓶0.2ml、1.5ml、2.0ml离心管各200-500个，50ml离心管2个10ul、200ul、1000ul 枪头各2盒50ml、100ml、250ml 、500ml三角瓶各2个去离子水或双蒸水500ml二、制备感受态大肠杆菌（所用超级感受态细胞制备试剂盒购于上海生工）BT Media 培养基制备：1支BT Media加50 ml蒸馏水配制，放入250ml三角瓶，高压灭菌即可准备工作：将BT Buffer A和BT Buffer B 放冰上遇冷，遇冷低温离心机至4℃1、用超低温冰箱中保存的菌种在LB平板上进行划线，置37℃培养箱中静置培养12-16h待菌落生长到1-2mm大小。
载体构建步骤
一．载体酶切线性化（TOYOBO EcoR I）1.载体pCDNA浓度0.8 ug/ul2.酶切体系（总50ul体系）pCDNA 3ul10*H Buffer 5ulddH2O 41ulEcoR I 1ul（8U/ul）3.反应条件37°C 1h 至多2h*已经试过37°C过夜，本以为会酶切充分，但是不想把条带全切成小片段了，而且电泳后是一条宽宽的泳谱*另外，多次酶切证实，所加的酶量过多在酶切一小时的情况下仍然会出现酶切过度的情况，尽可能按照说明书上的量和时间做二．取2ul稀释成5ul于1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定有无条带及大小用大凝胶回收pcDNA（按2.5：1加入SYBR Green）电泳30min准备两支EPPendorf管，调60°C水浴锅切胶称重（1.5ml EPPendorf管重约0.82g）三．OMEGA gel purification kit回收pcDNA1.平衡柱子加200ulBuffer GPS到DNA收集柱中，静置4min，12000xg*2min，加700ulDEPC处理H2O，12000xg*2min2.溶胶按1ml/kg的比例加Binding Buffer到凝胶中3.60°C水浴7mins，迅速转移至DNA收集柱中（至多700ul，超过的再转移一次），10000xg*1min，弃收集管中的液体4.加300ulBinding Buffer，10000xg*1min，弃收集管中的液体5.加700ulwash Buffer，10000xg*1min，弃收集管中的液体6.加350ulwash Buffer，10000xg*1min，弃收集管中的液体7.最大转速（>13000rpm）空转2min，弃收集管8.转移收集柱至1.5mlEPPendorf管，打开盖子静置2min9.加30ulElution Buffer静置2min，最大转速1.5min，弃收集柱10.取2ul稀释成5ul点胶*所加Elution Buffer的量是根据所纯化的产物的量来判断的，如果回收产物较多可以增加其量至50ul*纯化的理论效率为70%，如果先加一次Elution Buffer 20ul，静置2min，1000xg*1min,然后再加一次Elution Buffer20ul，静置离心。
常用载体通用引物
PBRforBam
PBRrevBam
pBR322(EcoRI/HindIII-sites)
pBRforEco
pBRrevHind
pBR325(BamHI-site)
PBRforBam
PBRrevBam
pBR329(BamHI-site)
PBRforBam
PBRrevBam
pDONR223
M13F
M13R
pDrive
T7/M13rev
SP6/M13for
pDsRED1-C1
(DsRed1-N-f)
DsRed1-C-r
pDsRed1-N1
CMV-Profor
RFP-Nrev,CMV-R?
pDsRed2-N1
(DsRed1-N-f)
DsRed1-C-r
pDsRed2-C1
BGH rev
pcDNA6/myc-His(A,B,C)
CMV-Profor,T7
BGH rev,c-mycrev
pcDNA6/V5-His(A,B,C)
CMV-Profor,T7
BGH rev,V5rev
pCEP4
pCEP-F/CMV-Profor
EBVrev
pCI
T7(17BASE)
EBVrev
T7,CMV-Profor
BGH rev,c-mycrev
pcDNA4/TO
TREfor/CMV-Profor
BGH rev
pcDNA4/V5-His(A,B,C)
CMV-Profor,T7
BGH rev,V5rev
pcDNA4-TET/0N/AMP+
庆大霉素检测卡说明书(完整版)
庆大霉素免疫胶体金快速检测试剂板使用说明书【产品简介】本产品用于快速检测组织（畜禽肉）中的庆大霉素残留，整个检测过程只需要15分钟左右，灵敏度为100μg/kg（ppb），适用于各类企业及检测机构。
【产品组成】庆大霉素免疫胶体金快速检测试剂板（40份/盒）庆大霉素专用PBST缓冲液（1瓶/盒）说明书（1份/盒）【未配套提供的试剂、器具】5 mL刻度冷冻管、天平、离心机、微量移液器【样品处理】1、取切碎的瘦肉组织样本（无脂肪）绞肉机搅碎，称取1g搅碎后肉样置于5mL离心管中；2、量取1mL庆大霉素专用PBST缓冲液加入上述刻度管内，剧烈振摇至样本呈糊状；3、4000r/min离心5min；4、取上清液100μL（3滴）直接滴板。
【使用步骤】测试前先完整阅读使用说明书，使用前将试剂板和待检样本溶液恢复至室温（20℃~30℃）。
●从原包装袋中取出试剂板，水平放置于观察者正面，如上图右侧所示（打开后请立即使用）；●用滴管吸取待检样品溶液，垂直滴加3滴（约100 μL）于加样孔中，加样后开始计时；●结果应在3～5分钟读取，其他时间判读无效。
【结果判断】阴性（－）：T线（检测线，靠近加样孔一端）比C线（对照线）深或一样深，表示样品中庆大霉素浓度低于100μg/kg或不含庆大霉素残留。
阳性（＋）：T线比C线浅，或T线无显色，表示样品中庆大霉素浓度高于100μg/kg；T线相比C线越浅，表示样品中庆大霉素浓度越高。
无效：未出现C线，可能操作不当或试剂板已失效。
在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试剂板重新测试。
【注意事项】●请勿触摸试剂板中央的白色膜面；●请勿使用过期的试剂板；●本公司提供的滴管请勿重复使用；●本公司提供的试剂请勿食用；●若需直接检测标准品，请用我方提供的PBST缓冲液进行配制。
●试剂板使用时室温不小于20℃【特异性】交叉反应率：庆大霉素----------------------100%链霉素------------------------<1%双氢链霉素----------------- --<1%新霉素------------------------<1%卡那霉素------------------- ---<1%【精密度】同时使用本产品和庆大霉素ELISA检测试剂盒对255份样品进行检测，包括145份阴性样本和110份阳性样本；检测结果表明本产品与氯霉素ELISA检测试剂盒的结果符合率为98.9％。
PPM植物组培抗菌保护剂使用说明中文版
PPM 说明书（中文版）PPM TM - Plant Preservative MixturePPM TM –植物组织培养抗菌保护剂FOR RESEARCH USE ONLYNot for use in diagnostic procedures产品名称：PPM TM- Plant Preservative Mixture（植物组织培养抗菌保护剂）货号：PPM保存条件：4º C运输条件：常温物理性质：溶液性状：无色至琥珀色透明液体pH值：3.8有效期：见瓶身标签说明产品描述：1.PPM TM 是一种热稳定的抗菌剂，用于植物组织培养中植物的微生物污染防治与清除；2.在合理的使用剂量下，PPM TM是一种非常有效的植物组培抗菌剂与保护剂，不会对植物的生长（如种子萌发，愈伤增殖、再生等）产生任何影响，可视为培养基标准配方成份；3.PPM TM主要用于预防和消除来自空气、水源或者人体接触等外界因素导致的植物组培过程中的微生物污染，同时，对于植物内生菌也同样具有非常好的抑制效果；4.PPM TM广泛适用于绝大多数被子植物和裸子植物，但是不推荐用于蕨类植物、藻类等水生植物；5.PPM TM具有热稳定性，能直接加入培养基高温灭菌而不会影响使用效果，使用更加方便；6.PPM TM 相对于常规抗生素而言，性价比更高。
作用机理：PPM TM的活性成分能渗透细菌或者真菌细胞壁，抑制呼吸作用中三羧酸循环和电子传递链过程中关键酶的活性，同时，也能阻断细菌和真菌吸收和利用培养基中单糖和氨基酸的过程，从而实现预防和清除植物组织培养过程中的微生物污染。
相对抗生素的优势：1.PPM TM能广泛抑制和清除细菌和真菌的污染，并防止真菌孢子的萌发；2.PPM TM是通过抑制多种酶的活性而达到抑菌效果，从而能避免耐药突变体的发生；3.PPM TM具有热稳定性，无需过滤灭菌，能直接加入培养基高温灭菌而不会影响使用效果，使用更加方便；4.PPM TM性价比更高，可更加广泛的应用于更多的科学研究、作物育种、组培苗工厂化生产中。
广宿主稳定表达载体pQMV和pGMP的构建
*基金项目：国家自然科学基金青年基金（No.39900004）和国家重点基础研究发展规化(973)项目（No.2001CB109005）资助。
胡玉琴:女，1962年生，博士研究生。
Email:<yuqinhu316a@>.**通讯作者。
Author for correspondence.E-mail:<dfh313@>.收稿日期：2003-05-13接受日期：2003-06-05农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2004,12(2):202~205·研究论文·广宿主稳定表达载体pQMV 和pGMP 的构建*胡玉琴1张杰1宋福平1束长龙1黄大昉2**（1.中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室，北京100094；2.中国农业科学院生物技术研究所，北京100081）摘要：以高效表达载体pET-29a 为基础，将广宿主载体pUCP19中稳定的假单胞菌（）质粒DNA 复制子和自行分离克隆的荧光假单胞菌()P303组成型表达启动子P P 303插入其中，分别获得了重组载体pQMV(4.6kb)和pGMP(5.6kb)。
它们均含有假单胞菌和大肠杆菌复制子、荧光假单胞菌内源强启动子，以及包含8~11个限制性内切酶多克隆酶切位点；此外，载体pGMP 还含有绿色荧光蛋白基因作为辅助检测标记。
连续培养和继代培养测定，这两种载体在荧光假单胞菌中的稳定性均为100%（120h ）。
关键词：绿色荧光蛋白基因；荧光假单胞菌；启动子；穿梭表达载体Construction of Stable Shuttle Expression Vectors pQMV and pGMPHU Yu-Qin 1ZHANG Jie 1SONG Fu-Ping 1SHU Chang-Long 1HUANG Da-Fang 2**(1.State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests,Institute of Plant Protection,Chinese Academyof Agricultural Sciences,Beijing 100094,China;2.Biotechnology Research Institute ,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China)The replicon ofplasmid DNA from pUCP19,and a new strong promoter P P 303,cloned fromP303strain,were inserted into plasmid pET-29a,a high level expression vector of.The recombinantshuttle expression plasmid pQMV(4.6kb)and pGMP(5.6kb)were obtained respectively.The vector pGMP containinggene wasespecially available for detection and monitoring.The stability of the two expression vectors were 100%(120h)in P303strain of.Both recombinant vectors will be powerful for research on gene expression,regulation and construction ofengineered strains of.green fluorescence protein gene ();;promoter;shuttle expression vector假单胞菌()是微生物的重要类群，具有很大的开发应用潜力。
载体构建操作流程
载体构建操作流程载体构建操作流程一、载体准备1、质粒准备电泳检测载体质量好的质粒为三条带，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）；也有观点认为是质粒两条链没有断裂的超螺旋结构，开环DNA和线性DNA。
超螺旋结构应至少占到90%。
测定质粒浓度用核酸定量仪测定质粒的浓度，A230、A260和A280值。
2、质粒双酶切根据需要的酶切位点，选择对应的酶，查找适合的Buffer，进行单酶切。
以TaKaRa的限制酶为例，双酶切的体系如下：试剂体积质粒<1 μgEnzyme I 1μLEnzyme II 1μL10×X Buffer 2μL灭菌水to 20μL总体积20μL将上述体系置于37℃（不同酶可能存在差异）水浴锅中酶切。
根据酶切效率不同确定酶切时间，可以去除2 μl进行电泳检测。
3、回收质粒凝胶回收参照TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒说明书。
1)称量胶块重量，计算胶块体积。
计算胶块体积时，以1mg=1μl进行计向胶块中加入胶块融化液Buffer GM，我们一般用1%的琼脂糖凝胶电泳，所以一般加入3个凝胶体积量。
2)均匀混合后室温15-25℃融化胶块。
此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约5～10分钟）。
3)将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。
将上述操作的溶液转移至Spin Column 中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。
滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA的回收率。
4)将700μl的Buffer WB加入Spin Column中，室温12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。
5)重复操作步骤。
6)将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12,000 rpm 离心1分钟。
7)将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。
宝创干式荧光免疫分析仪标准操作程序
宝创干式荧光免疫分析仪标准操作程序1、目的规范检测的操作流程，保证测试结果的准确性。
2、原理结核分枝杆菌复合群的感染，可以引起血液中的记忆淋巴细胞免疫识别，并产生和分泌相应因子，如γ-干扰素。
因此，对全血细胞进行特异性结核抗原刺激，通过其释放的γ-干扰素进行定量测定，可判定是否存在针对结核分枝杆菌复合群特异性的细胞免疫反应。
根据以上原理，结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒选取含有结核杆菌特异性抗原（ESAT-6和CFP-10）作为刺激抗原，与新鲜的肝素锂抗凝全血充分混合孵育23-24小时，使用干式荧光免疫分析仪定量检测血浆中的γ-干扰素浓度。
同时，引入空白阴性对照管和植物凝血素阳性对照管，作为对无法肯定受试者的免疫状况或血液处理及孵育过程的对照，排除实验中因样本不理想或操作错误引起的假阴性或假阳性结果，使检测结果更加的准确。
3、适用仪器广州市宝创生物技术有限公司的干式荧光免疫分析仪（DFIA100、DFIA200、DFIA300）。
4、实验操作所需器材和试剂1.厂家提供：结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒干式荧光免疫分析仪（DFIA100、DFIA200、DFIA300）2.实验室自备：5、试剂储存条件及主要组成成分5.1(4-30)℃避光干燥保存，不得冻存。
有效期12个月。
检测卡的铝箔袋开封后，检测卡需在1小时内尽快使用。
5.2试剂主要组成成分注：不同批号试剂盒中各组成成分不得互换使用。
6、产品性能指标6.1最低检测限：本试剂盒的最低检出限≦0.25IU/ml6.2阴性参考品符合率：检测15份随机健康人的新鲜全血样本，阴性参考品符合率不低于75%。
6.3阳性参考品符合率:检测20例结核病患者的新鲜全血样本，阳性参考品符合率不低于80%。
6.4精密度6.4.1 取一份结核病患者的新鲜全血样本进行3次重复检测，结果均为阳性;6.4.2用企业精密度参考品J1、J2分别进行10次重复检测，检测结果的变异系数（CV）≦15%。
Rosetta(DE3)大肠杆菌表达菌株使用说明
GGA 稀有密码子的 tRNA，该质粒具有氯霉素抗性。Rosetta(DE3)通过提供
稀 有 密 码 子 ， 使 得 该 宿 主 菌 相 对 于 其 他 大 肠 杆 菌 ， 能 够 提 供 更 加 “通 用 ”的
蛋白质表达，从而提升目的蛋白表达水平。DE3 是溶源性的 λDE3, 所以带
名称：Rosetta(DE3)大肠杆菌表达菌株
规格：300ul 甘油菌
储存温度：-‐80℃
基 因 组 ：
F– ompThsdSB(rB-‐ mB-‐) gal dcm (DE3)pRARE2(CamR)
简 介 ：
Rosetta 系列菌株来源于 BL21 系列宿主菌，该系列菌株含有原本在大
肠杆菌中稀少的真核细胞密码子，增加了真核细胞的蛋白表达水平。
Rosetta(DE3)菌株含有 pRARE 质粒，能够提供 AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, 和
有 T7 RNA 聚合酶的染色体拷贝。该菌株适用于 pET 系列载体，及其他 T7
启 动 子 系 列 载 体 。
操作说明：
1，本品包含一份甘油菌，使用本甘油菌时可以不用完全融解，在甘油菌表
面蘸取少量涂板或进行液体培养即可。也可以完全融解后使用，但随着冻融次数
的增加，细菌的活力会逐渐下降。
2，为保证菌种纯正，避免其它细菌污染，尽量先划平板，然后再挑单克隆
菌落进行后续操作。
冷 冻 管 开 封 ：
用浸过 75%酒精的脱脂棉严格消毒冷冻管盖。
菌 株 复 溶 ：
无菌环境中旋开装有复溶液的滴瓶盖，吸取 1ml 左右复溶液，加入到冷冻
rosetta系列菌株来源于bl21系列宿主菌该系列菌株含有原本在大肠杆菌中稀少的真核细胞密码子增加了真核细胞的蛋白表达水平
人高迁移率族蛋白B1酶联免疫分析试剂盒使用方法
人高迁移率族蛋白B1酶联免疫分析试剂盒使用方法本试剂盒仅供研究使用。
检测范围：96T 8μg/L -160μg/L使用目的：本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中高迁移率族蛋白B1（HMGB-1）含量。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人高迁移率族蛋白B1（HMGB-1）水平。
用纯化的人高迁移率族蛋白B1（HMGB-1）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入高迁移率族蛋白B1（HMGB-1），再与HRP 标记的高迁移率族蛋白B1（HMGB-1）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。
TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的高迁移率族蛋白B1（HMGB-1）呈正相关。
用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中人高迁移率族蛋白B1（HMGB-1）浓度。
试剂盒组成1 30 倍浓缩洗涤液 20ml×1 瓶 7 终止液 6ml×1 瓶2 酶标试剂 6ml×1 瓶 8 标准品（320μg/L） 0.5ml×1 瓶3 酶标包被板 12 孔×8 条 9 标准品稀释液 1.5ml×1 瓶4 样品稀释液 6ml×1 瓶 10 说明书 1 份5 显色剂A 液 6ml×1 瓶 11 封板膜 2 张6 显色剂B 液 6ml×1/瓶 12 密封袋 1 个标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3 的样品，因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
160μg/L 5 号标准品 150μl 的原倍标准品加入150μl 标准品稀释液80μg/L 4 号标准品 150μl 的5 号标准品加入150μl 标准品稀释液40μg/L 3 号标准品 150μl 的4 号标准品加入150μl 标准品稀释液20μg/L 2 号标准品 150μl 的3 号标准品加入150μl 标准品稀释液10μg/L 1 号标准品 150μl 的2 号标准品加入150μl 标准品稀释液2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。
毕赤酵母表达载体及宿主菌介绍
由于甲醇营养型酵母菌体内无天然质粒，所以携带外源基因的重组体必须整合于染色体中才能实现外源基因的表达。
整合表达的优点在于保持外源基因稳定性并可产生多拷贝基因。
典型的毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括：5’AOX1启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4或Zeocin)、3’AOX1基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322质粒或COLE1序列。
如果是分泌型表达载体，在多克隆位点的前面，外源基因的5’端和启动子的3’端之间插人了分泌作用的信号肽序列。
在这个分泌信号的引导下，外源蛋白在内质网和高尔基体中经修饰和加工后能够由胞内转移至胞外，将成熟的蛋白质分泌到细胞外。
为方便于操作，通常表达载体都是穿梭质粒。
表达载体与酵母染色体有单交换和双交换整合2种方式，单交换整合时，或插入A0X1位点，或插入his位点。
有文献报道，以his4作为整合位点时，染色体突变株与表达盒间存在基因转换，偶而可使Laz表达盒丢失，故AOX1位点更好。
一般认为，单交换转化效率比双交换效率高，且易得到多拷贝整合，其发生机制可能是重复单交换引起的。
携带外源基因的表达载体可通过电穿孔、原生质体生成法或全细胞法转化酵母细胞。
甲醇酵母转化和大肠埃希氏菌转化不同之处是前者较为复杂。
对于大肠埃希氏菌而言，只要把重组表达载体导入细胞体内即可。
因其载体上携带有自身复制原点，可随染色体复制而复制，重组表达载体能够稳定存在。
在甲醇酵母系统中，所有的表达载体均不含酵母复制原点。
这就是说，导入酵母体内的重组表达载体只有和酵母染色体上的同源区发生重组，整合到染色体上，外源基因才能够稳定存在，外源蛋白才能得到稳定表达，这种整合的转化子一旦形成就非常稳定。
如果转化后的重组表达载体未能整合到染色体上，而是以游离的附加体形式存在，这种转化子就不稳定，重组表达载体极易丢失。
整理)慢病毒稳转细胞株步骤之欧阳物创编
稳转慢病毒一、所需试剂1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年）（1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env 序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分（2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分（3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因.三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。
2、包装细胞：293T细胞3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌**也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。
是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene能提高感染效率2～10 倍。
有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml）7、无血清培养基：optimen8、贴壁细胞（复苏后3代以上的细胞）9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞二、具体步骤<一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转）第一天1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜2、配制5X PEG8000/NaCl溶液称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度30min 湿热灭绝30min；保存在4℃第二天1、配管A+B混合室温静置20min2、加入2ml全培养基DMEM3、将1加入2，孵育10h，换成5ml全培养基第四天第五天：1、9:00和17:00各收取一次5ml培养液，共20ml（-80℃保存）2、过滤：用孔径为0.45mm的过滤器除去上清中的293T 细胞3、加入5ml 5XPEG8000/NaCl溶液，每30min-1h上下摇匀一次4、4℃过夜第六天1、4℃，3500rpm，20min2、弃上清，倒扣纸上静置1-2min，吸干残余液体3、加入120-150μl PBS，缓慢吹打，以防形成气溶胶4、50μl分装，-80℃保存。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
pBMTB-1编号载体名称北京华越洋VECT75119pBMTB-1pBMTB-1载体基本信息：载体名称:pBMTB-1质粒类型:广宿主载体；克隆载体；原核表达载体高拷贝/低拷贝:--克隆方法:限制性内切酶，多克隆位点启动子:araBAD载体大小:5029bp5'测序引物及序列:--3'测序引物及序列:--载体标签:--载体抗性:氨苄青霉素克隆菌株:DH5α等宿主细胞（系）:多个菌属备注:--组成型/诱导型:诱导型pBMTB-1载体质粒图谱和多克隆位点信息：pBMTB-1载体序列：ORIGIN1aacgaattca agcttgatat cattcaggac gagcctcaga ctccagcgta actggactga 61aaacaaacta aagcgccctt gtggcgcttt agttttgttc cgctcatgat aataatggtt 121tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg cccgcgttcc tgctggcgct 181gggcctgttt ctggcgctgg acttcccgct gttccgtcag cagcttttcg cccacggcct 241tgatgatcgc ggcggccttg gcctgcatat cccgattcaa cggccccagg gcgtccagaa 301cgggcttcag gcgctcccga aggtctcggg ccgtctcttg ggcttgatcg gccttcttgc 361gcatctcacg cgctcctgcg gcggcctgta gggcaggctc atacccctgc cgaaccgctt 421ttgtcagccg gtcggccacg gcttccggcg tctcaacgcg ctttgagatt cccagctttt 481cggccaatcc ctgcggtgca taggcgcgtg gctcgaccgc ttgcgggctg atggtgacgt 541ggcccactgg tggccgctcc agggcctcgt agaacgcctg aatgcgcgtg tgacgtgcct 601tgctgccctc gatgccccgt tgcagcccta gatcggccac agcggccgca aacgtggtct 661ggtcgcgggt catctgcgct ttgttgccga tgaactcctt ggccgacagc ctgccgtcct 721gcgtcagcgg caccacgaac gcggtcatgt gcgggctggt ttcgtcacgg tggatgctgg 781ccgtcacgat gcgatccgcc ccgtacttgt ccgccagcca cttgtgcgcc ttctcgaaga 841acgccgcctg ctgttcttgg ctggccgact tccaccattc cgggctggcc gtcatgacgt 901actcgaccgc caacacagcg tccttgcgcc gcttctctgg cagcaactcg cgcagtcggc 961ccatcgcttc atcggtgctg ctggccgccc agtgctcgtt ctctggcgtc ctgctggcgt 1021cagcgttggg cgtctcgcgc tcgcggtagg cgtgcttgag actggccgcc acgttgccca 1081ttttcgccag cttcttgcat cgcatgatcg cgtatgccgc catgcctgcc cctccctttt 1141ggtgtccaac cggctcgacg ggggcagcgc aaggcggtgc ctccggcggg ccactcaatg 1201cttgagtata ctcactagac tttgcttcgc aaagtcgtga ccgcctacgg cggctgcggc 1261gccctacggg cttgctctcc gggcttcgcc ctgcgcggtc gctgcgctcc cttgccagcc 1321cgtggatatg tggacgatgg ccgcgagcgg ccaccggctg gctcgcttcg ctcggcccgt 1381ggacaaccct gctggacaag ctgatggaca ggctgcgcct gcccacgagc ttgaccacag 1441ggattgccca ccggctaccc agccttcgac cacataccca ccggctccaa ctgcgcggcc 1501tgcggccttg ccccatcaat ttttttaatt ttctctgggg aaaagcctcc ggcctgcggc 1561ctgcgcgctt cgcttgccgg ttggacacca agtggaaggc gggtcaaggc tcgcgcagcg 1621accgcgcagc ggcttggcct tgacgcgcct ggaacgaccc aagcctatgc gagtgggggc 1681agtcgaaggc gaagcccgcc cgcctgcccc ccgagcctca cggcggcgag tgcgggggtt 1741ccaagggggc agcgccacct tgggcaaggc cgaaggccgc gcagtcgatc aacaagcccc 1801ggaggggcca ctttttgccg gagggggagc cgcgccgaag gcgtggggga accccgcagg 1861ggtgcccttc tttgggcacc aaagaactag atatagggcg aaatgcgaaa gacttaaaaa 1921tcaacaactt aaaaaagggg ggtacgcaac agctcattgc ggcacccccc gcaatagctc 1981attgcgtagg ttaaagaaaa tctgtaattg actgccactt ttacgcaacg cataattgtt 2041gtcgcgctgc cgaaaagttg cagctgattg cgcatggtgc cgcaaccgtg cggcacccta 2101ccgcatggag ataagcatgg ccacgcagtc cagagaaatc ggcattcaag ccaagaacaa 2161gcccggtcac tgggtgcaaa cggaacgcaa agcgcatgag gcgtgggccg ggcttattgc 2221gaggaaaccc acggcggcaa tgctgctgca tcacctcgtg gcgcagatgg gccaccagaa 2281cgccgtggtg gtcagccaga agacactttc caagctcatc ggacgttctt tgcggacggt 2341ccaatacgca gtcaaggact tggtggccga gcgctggatc tccgtcgtga agctcaacgg 2401ccccggcacc gtgtcggcct acgtggtcaa tgaccgcgtg gcgtggggcc agccccgcga 2461ccagttgcgc ctgtcggtgt tcagtgccgc cgtggtggtt gatcacgacg accaggacga2521atcgctgttg gggcatggcg acctgcgccg catcccgacc ctgtatccgg gcgagcagca 2581actaccgacc ggccccggcg aggagccgcc cagccagccc ggcattccgg gcatggaacc 2641agacctgcca gccttgaccg aaacggagga atgggaacgg cgcgggcagc agcgcctgcc 2701gatgcccgat gagccgtgtt ttctggacga tggcgagccg ttggagccgc cgacacgggt 2761cacgctgccg cgccggtagt acgtaagagg ttccaacttt caccataatg aaataagatc 2821actaccgggc gtattttttg agttatcgag attttcagga gctaaggaag ctaaaatgag 2881tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt 2941tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt 3001gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagtttac gccccgaaga 3061acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat 3121tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga 3181gtactcacca gtcacagaaa agcatctcac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag 3241tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctggcaa cgatcggagg 3301accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg 3361ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt 3421agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg 3481gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggatcacttc tgcgctcggc 3541cctcccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg 3601tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgc atcgtagtta tctacacgac 3661ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact 3721gattaagcat tggtaatgag gatccccctc aagtcaaaag cctccggtcg gaggcttttg 3781actttctgct atggaggtca ggtatgattt ttatgacaac ttgacggcta catcattcac 3841tttttcttca caaccggcac ggaactcgct cgggctggcc ccggtgcatt ttttaaatac 3901ccgcgagaaa tagagttgat cgtcaaaacc aacattgcga ccgacggtgg cgataggcat 3961ccgggtggtg ctcaaaagca gcttcgcctg gctgatacgt tggtcctcgc gccagcttaa 4021gacgctaatc cctaactgct ggcggaaaag atgtgacaga cgcgacggcg acaagcaaac 4081atgctgtgcg acgctggcga tatcaaaatt gctgtctgcc aggtgatcgc tgatgtactg 4141acaagcctcg cgtacccgat tatccatcgg tggatggagc gactcgttaa tcgcttccat 4201gcgccgcagt aacaattgct caagcagatt tatcgccagc agctccgaat agcgcccttc 4261cccttgcccg gcgttaatga tttgcccaaa caggtcgctg aaatgcggct ggtgcgcttc 4321atccgggcga aagaaccccg tattggcaaa tattgacggc cagttaagcc attcatgcca 4381gtaggcgcgc ggacgaaagt aaacccactg gtgataccat tcgcgagcct ccggatgacg 4441accgtagtga tgaatctctc ctggcgggaa cagcaaaata tcacccggtc ggcaaacaaa 4501ttctcgtccc tgatttttca ccaccccctg accgcgaatg gtgagattga gaatataacc 4561tttcattccc agcggtcggt cgataaaaaa atcgagataa ccgttggcct caatcggcgt 4621taaacccgcc accagatggg cattaaacga gtatcccggc agcaggggat cattttgcgc 4681ttcagccata cttttcatac tcccgccatt cagagaagaa accaattgtc catattgcat 4741cagacattgc cgtcactgcg tcttttactg gctcttctcg ctaaccaaac cggtaacccc 4801gcttattaaa agcattctgt aacaaagcgg gaccaaagcc atgacaaaaa cgcgtaacaa 4861aagtgtctat aatcacggca gaaaagtcca cattgattat ttgcacggcg tcacactttg 4921ctatgccata gcatttttat ccataagatt agcggatcct acctgacgct ttttatcgca 4981actctctact gtttctccat acccgttttt ttgggctaga gaattcgtc//pBMTB-1其他相关广宿主载体：pMHE3Tc pCS2+8pCSDest pSPORT2pMHE5Tc pMHE7Tc pMHE7pMHE6pMHE5pMHE3pMHE2pBBR1MCS-6 pBBR1-GFP pBMTB-5pBMTB-4pBMTB-3 pBMTB-2pBMTB-1pBTL-5pBTL-4pBTL-3pBTL-2pBTL-1pBTB-5pBTB-4pBTB-3pBTB-2pBTB-1pBT-5pBMT-5pBMT-4pBMT-3pBMT-2pBMT-1pBT-4pBT-2pBT-3pBT-1pCS2+MT pCS2+8CmCherry pCS2+8CeGFP pMMB207pCS22+pCS2+pCS2-pCS111pCS108pCS107pBBR1MCS pBBR1MCS-5pBBR1MCS-4pBBR1MCS-3 pBBR1MCS-2。