HE染色概念及定义

He染色介绍
苏木精—伊红染色法( hematoxylin-eosin staining ) ，简称HE染色法，石蜡切片技术里常用的染色法之一。

苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质与细胞外基质中的成分着红色。

染色分类
易于被碱性或酸性染料着色的性质称为嗜碱性
( basophilia )与嗜酸性( acidophilia ) 。

组织内的蛋白质构成蛋白质的氨基酸的种类很多，它们有不同的等电点。

在普通染色法中，染色液的酸碱度为pH6左右，细胞内的酸性物质如细胞核的染色质、腺细胞与神经细胞内的粗面内质网及透明软骨基质等均被碱性染料染色，这些物质称为嗜碱性。

而细胞质中的其它蛋白质如红细胞中的血红蛋白、嗜酸粒细胞的颗粒及胶原纤维与肌纤维等被酸性染料染色，这些物质称为嗜酸型。

如果改变染色液的酸碱度，pH值升高时，则原来被酸性染料染色的物质可变为嗜碱性；pH值降低时，原来被碱性染料染色的物质则可变为嗜酸性。

所以说染色液的pH值可以影响染色的反应。

去氧核糖核酸（DNA）两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键结
合而被染色。

苏木精在碱性溶液中称蓝色，所以细胞核被染成蓝色。

伊红Y是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷的阳离子结合使胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明对比。

伊红是细胞浆的良好染料。

由于组织或细胞的不同成分对苏木精的亲与力不同及染色性质不一样。

经苏木精染色后，细胞核及钙盐粘液等呈蓝色，可用盐酸酒精分化与弱碱性溶液显蓝，如处理适宜，可使细胞核着清楚的深蓝色，胞浆等其它成分脱色。

再利用胞浆染料伊红染胞浆，使胞浆的各种不同成分又呈现出深浅不同的粉红色。

故各种组织或细胞成分与病变的一般形态结构特点均可显示出来。

染色结果
细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色。

细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色，胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色。

胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色，红血球呈橘红色，蛋白性液体呈粉红色。

着色情况与组织或细胞的种类有关，也随其生活周期及病理变化而改变。

例如，很多细胞在新生时期胞浆对伊红着色较
淡或轻度嗜碱，当其衰老时或发生退行性变则呈现嗜伊红浓染。

胶原纤维在老化与出现透明变性时，伊红着色由浅变深。

常规HE染色步骤
（1）二甲苯（Ⅰ）5-10 min
(2) 二甲苯（Ⅱ）5-10 min
(3) 95%乙醇（Ⅰ）1-3 min （4）95%乙醇（Ⅱ）1-3 min （5）80%乙醇 1 min （6）蒸馏水 1 min （7）苏木精液染色5-15 min
(8 ) 流水稍洗去苏木精液1-3 s
(9) 1%盐酸乙醇1-3 s
(10) 稍水洗10-30 s
(11)促蓝液返蓝10-30 s
(12) 流水冲洗10-15 min （13）蒸馏水过洗1-2 s
(14) 0.5%曙红液染色1-3 min
(15) 蒸馏水稍洗1-2 s
(16) 80%乙醇稍洗1-2 s
(17) 95%乙醇（Ⅰ）3-5min
(18) 95%乙醇（Ⅱ）3-5 min
(19) 无水乙醇5-10
min
(20) 无水乙醇5-10 min
(21) 二甲苯（Ⅰ）3-5 min
(22) 二甲苯（Ⅱ）2-5 min
(23) 二甲苯（Ⅲ）3-5 min
(24) 中性树胶封固
结果：细胞浆红色，细胞核蓝紫色。

一、操作方法及步骤：
①取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。

②取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。

小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。

③将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。

④调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。

二、冰冻切片时的注意事项：
①防卷板及切片刀与持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余与用柔软的纸张擦。

有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。

因为这个地方是切片通过与附贴的地方，如果有残
余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。

②多例多块组织同时需做冰冻切片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。

③放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，所谓“砍柴看柴势”，切片也是如此，如果胡乱放置，就不能收到很好的效果。

④组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不能使用。

临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。

如果使用未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰晶。

这是因为含水的固定液在组织未经固定前，其中的水份也可渗入到组织中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中，形成了冰晶。

⑤当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。

另者，调高冰冻点。

⑥用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。

因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发
生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。

如果使用冷藏的载玻片来附贴切片，由于温度相同，没有发生上述的现象。

三、冰冻切片的快速染色方法：
①切片固定30秒－1分钟。

②水洗。

③染苏木素3－5分钟。

④分化。

⑤于碱水中返蓝20秒。

⑥伊红染色10－20秒。

⑦脱水，透明，中性树胶封固。

冰冻组织1－2分钟，切片1分钟，固定1分钟，染色共五分钟。

总共在10分钟内完成快速制片过程，结果与石蜡切片不相上下。

冰冻切片的方法还有很多种，如甲醇循环的半导体冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，半导体冰冻切片法与氯乙烷冰冻切片法等，这些方法在目前来说已很少使用，因此在这里不作阐述。

常规方法：
（1）冰冻切片固定 10～30 s
（2）稍水洗1～2 s
（3）苏木精液染色（60℃）30～60 s
（4）流水洗去苏木精液 5～10 s
（5）1%盐酸乙醇 1～3 s
（6）稍水洗 1～2 s
（7）促蓝液返蓝5～10 s
（8）流水冲洗 15～30 s
（9）0.5%曙红液染色30～60 s
（10）蒸馏水稍洗 1～2 s
（11）80%乙醇 1～2 s
（12）95%乙醇1～2 s
（13）无水乙醇1～2 s
（14）石炭酸二甲苯2～3 s
（15）二甲苯（Ⅰ） 2～3 s
（16）二甲苯（Ⅱ）2～3 s
（17）中性树胶封固。

注：第（14）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇，染色结果为：细胞核蓝色、胞质、肌纤维、胶原纤维与红细胞呈深浅不一的红色。

封片切片染色后封片常用中性树胶，酸性的树胶可使胞核褪色，如树胶放置时间过长，因氧化而变酸。

中性树胶可用二甲苯稀释。

树胶过浓，封片时容易导致气泡；过稀，封片时易使胶外溢，影响美观，也会出现由于二甲苯挥发后缺胶的现象。

在整个染色过程中不让切片干涸：切片完全干涸，会使组织收缩与出现裂痕即出现所谓“龟裂”现象。

也会使部分细胞核透明不良，看起来像黑色的细胞核，即形成“黑核”。